农业有害微生物的绿色控制方法研究——外源羟基自由基杀灭机理和植物内源抗病基因克隆研究

摘要

农业有害微生物在农业生产的各个环节会对农作物和农产品造成污染，这不仅导致农作物减产、农产品品质下降，造成巨大经济损失，而且有些病原性微生物会产生毒素，甚至引发流行性疾病。同时，农业有害微生物还会污染环境，对人类造成长期的潜在危险，影响到社会稳定乃至国民经济的持续发展。目前，我国防治农业有害微生物的方法多样，但在实际应用中均存在有不同的缺陷，如杀灭不完全，尤其是对一些产芽孢的烈性致病细菌的控制非常困难;大多数化学方法处理难以避免存在环境污染问题等。
　　 论文提出利用绿色技术控制农业有害微生物，如可利用高级氧化技术，对农业生产原料、废弃物和排泄物等进行灭菌，也可对农业生产环境和农产品储藏室进行消毒。同时，可通过培育和推广作物抗病品种，在农作物收获前就控制病原菌，从而低成本高效益地预防、消除或减小农业有害微生物造成的危害。
　　 论文的研究内容主要包括以下两部分:
　　 第一部分，农业有害微生物的外源性羟基自由基控制研究
　　 高级氧化技术(AOT)可通过反应产生极具氧化性的羟基自由基，它几乎能和所有的生物大分子、有机物和无机物发生不同类型的化学反应，直至彻底转化为二氧化碳和水等无害物质。论文采用强电场电离放电法制备高浓度羟基自由基，以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和芽孢为模型，研究外源性羟基自由基对农业有害微生物的生物学效应及作用机理，具体内容如下:
　　 1、外源性羟基对G-细菌的杀灭效应及作用机制
　　 研究以大肠杆菌为模型，采用不同浓度的外源性羟基自由基处理大肠杆菌，发现羟基浓度超过0.4mg/L时即能导致其全部死亡，这表明羟基浓度对G-细菌有高效的杀灭作用。对生物大分子含量及完整性的分析表明，羟基能进入细胞内损伤DNA、RNA和蛋白质。对胞内电解质渗漏率和膜脂氧化程度的分析表明，羟基能直接对细胞膜造成重大损伤。扫描电镜和透射电镜观察发现，当用0.2mg/L羟基溶液处理时，细菌形态扭曲，细胞壁与细胞膜之间出现明显的空隙;当用1.0mg/L羟基溶液处理时，细菌保持杆状，但细胞壁上出现不规则褶皱。羟基处理还使胞内的拟核变得模糊，甚至消失。综合上述结果，外源性羟基自由基不仅能损伤细胞壁、细胞膜等外部结构，也能损伤胞内结构和胞内生物大分子，从而导致G-细菌死亡。
　　 2、外源性羟基对G+细菌及芽孢的杀灭效应及作用机制。
　　 致死效应研究表明，羟基也能有效杀灭枯草芽孢杆菌及芽孢，但完全杀灭它们所需的浓度分别为0.8mg/L和1.0mg/L，远高于杀灭大肠杆菌所需的浓度(0.4mg/L)，这可能是由于枯草芽孢杆菌及芽孢的外壁比大肠杆菌厚造成的。电镜结果显示，不同浓度的羟基处理枯草芽孢杆菌时，菌体基本保持杆状，但其表面会出现褶皱，用0.2mg/L羟基溶液处理时，仅少数菌体表面出现褶皱，当羟基浓度提高至1.0mg/L时，所有菌体表面出现大量规则的竖条形纹路，超薄切片观察显示，胞内的拟核变模糊。对芽孢的扫描电镜观察表明，0.4mg/L羟基溶液不会引起芽孢表面结构的变化，而当羟基浓度提高到1.0mg/L时，芽孢体积大为缩小，不足正常芽孢的1/9，并在芽孢全周布满凸起物。透射电镜结果显示，受损芽孢的外部结构呈解体状态，而芽孢内部呈深色，表明其致密度很高。由此推测，G+细菌的细胞壁和芽孢的芽孢壁等都是外源性羟基自由基的攻击靶标。
　　 3、利用绿色荧光蛋白监测外源性羟基对大肠杆菌的杀灭效果。
　　 研究采用基因工程技术制备了重组绿色荧光蛋白(EGFP)，并构建了能组成型表达EGFP的工程菌E.coli-EGFP。离体研究表明，羟基溶液能有效淬灭重组EGFP的绿色荧光，当羟基浓度为0.2mg/L时，绿色荧光强度可降至48.25％，当羟基浓度增加到0.4mg/L以上时，绿色荧光基本消失。菌体研究表明，当羟基浓度为0.3mg/L时，工程菌的荧光强度可减至33.22％，当羟基浓度超过0.8mg/L时，荧光信号基本消失。结合工程菌的死亡率数据发现，用0.2-1.0mg/L羟基溶液处理工程菌时，相对荧光强度与工程菌死亡率存在相关性，符合曲线方程:y=0.0009x2-0.0276x+0.0525(R2=0.9923)。该结果表明，借助工程菌胞内EGFP的荧光强度，可监测羟基溶液杀灭大肠杆菌是否彻底。
　　 第二部分，农作物病原微生物的基因控制研究
　　 培育和推广抗病品种是防治作物病害最经济、安全和有效的途径，其关键在于发掘和利用新的抗性资源。小麦白粉病是小麦三大病害之一，严重威胁着小麦生产。小麦野生近缘物种簇毛麦所携带的抗白粉病基因Pm21是目前最优秀的小麦白粉病抗源，但对其遗传基础尚缺乏足够的认识。论文借助比较基因组学高效开发携带Pm21基因的6VS缺失片段FL0.45-0.58及附近的CISP标记，构建高密度比较基因组图谱，进而采用RGA克隆法获得Pm21候选基因。研究的主要内容如下:
　　 1、簇毛麦抗白粉病基因Pm21的精细定位
　　 论文对已报道的4个6VS标记进行缺失定位，将携带Pm21基因的缺失片段FL0.45-0.58定位于标记Xcinau(l)88和CINAU91之间。对现有的12个6VS标记在二穗短柄草基因组中进行电子定位，构建低密度比较基因组图谱。选择二穗短柄草第3号染色体短臂(3BdS)上连续的200个基因作为目标区，经共线性分析后，针对其中的69个基因设计了94对CISP引物，筛选到22个6VS特异性CISP标记。缺失定位分析表明，4个CISP标记定位于缺失片段FL0.58-1.0，10个定位于FL0.45-0.58，8个定位于FL0-0.45，从而将携带Pm21基因的FL0.45-0.58精细定位于CISP标记6VS-CISP027与6VS-CISP145之间，并构建了高密度比较基因组图谱。
　　 2、采用RGA克隆法克隆Pm21候选基因
　　 研究以植物R基因保守的NBS结构域作为种子序列，对二穗短柄草全基因组中的R基因进行鉴定，发现全基因组中存在299个R基因，其中3BdS染色体上有30个R基因，其结构以CC-NBS-LRR和NBS-LRR为主。根据高密度比较基因组图谱，将二穗短柄草的R5-R8基因视为簇毛麦Pm21基因的同源物，针对其保守序列设计简并引物，采用RGA克隆法从簇毛麦中获得3个R基因片段。缺失定位分析表明，仅Hv-R1基因定位于缺失片段FL0.45-0.58。利用RT-PCR技术进行转录分析，发现Hv-R1基因能组成型表达，并受白粉菌诱导增强表达。利用TAIL-PCR技术获得完整的Hv-R1基因，全长为5309bp，编码区为2568bp，其中内含子为250bp。Hv-R1基因编码的蛋白质为855个氨基酸残基，与二穗短柄草R5-R7基因的编码蛋白具有很高的同源性(72％-77％)。蛋白质结构域分析表明，簇毛麦Hv-R1基因为典型的CC-NBS-LRR类R基因。启动子模序分析发现，Hv-R1基因上游除了CAAT-box和TATA-box，还有W-box、MYB和MYC转录因子识别位点等多种抗病相关的启动子模序，它们可能对Hv-R1基因起重要的调控作用。研究不仅为Pm21候选基因的功能鉴定奠定了良好的基础，也为克隆孤儿作物中的目的基因提供了新的思路和方法。
　　 研究揭示了外源性羟基自由基杀灭大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、芽孢的生物学效应及作用机理，并构建了能用于监测羟基杀菌效果的基因工程菌，为外源性羟基自由基控制农业有害微生物提供了重要依据。本研究还采用基于比较基因组学的RGA克隆法从簇毛麦中获得了Pm21候选基因，为其功能鉴定奠定了基础，也为利用该基因培育抗病品种、控制小麦抗白粉病提供了必要的依据。

目录

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摘要

第一章 绪论

1．1 农业有害微生物的危害及其控制

1．1．1 农业有害微生物的危害

1．1．2 农业有害微生物的常规防治方法

1．2 羟基自由基控制有害微生物

1．2．1 羟基自由基技术的特点

1．2．2 羟基自由基在有害微生物控制中的应用

1．3 植物内源性抗病基因与植物病害的防治

1．3．1 植物抗病基因的结构与分类

1．3．2 植物抗病基因的克隆方法

1．3．3 麦类作物的比较基因组学研究进展

1．4 本论文研究的目的、意义和内容

1．4．1 本论文研究的目的和意义

1．4．2 本论文研究的主要内容

第二章 外源性羟基自由基杀灭大肠杆菌的研究

2．1 实验材料与方法

2．1．1 生物材料

2．1．2 羟基制备及浓度测定

2．1．3 羟基处理

2．1．4 细菌致死率分析

2．1．5 生物大分子含量及完整性检测

2．1．6 膜损伤程度检测

2．1．7 电镜观察

2．2 结果与分析

2．2．1 羟基对大肠杆菌的致死效应

2．2．2 羟基对生物大分子的损伤效应

2．2．3 羟基对细胞膜的损伤效应

2．2．4 羟基对细胞结构的损伤效应

2．3 讨论

第三章 外源性羟基自由基杀灭枯草芽孢杆菌及其芽孢的研究

3．1 实验材料与方法

3．1．1 生物材料

3．1．2 芽孢的制备

3．1．3 其他方法

3．2 结果与分析

3．2．1 羟基对枯草芽孢杆菌及芽孢的致死效应

3．2．2 羟基对枯草芽孢杆菌生物大分子的损伤效应

3．2．3 羟基对枯草芽孢杆菌细胞膜的损伤效应

3．2．4 羟基对枯草芽孢杆菌及芽孢结构的损伤效应

3．3 讨论

第四章 利用绿色荧光信号监测外源性羟基杀菌效果的研究

4．1 实验材料与方法

4．1．1 生物材料

4．1．2 PCR扩增EGFP基因

4．1．3 EGFP基因和表达载体的pET-28a的酶切与连接

4．1．4 连接产物的转化[74]

4．1．5 质粒DNA的提取

4．1．6 Pm启动子取代T7启动子[75]

4．1．7 重组EGFP的分离纯化

4．1．8 羟基处理重组EGFP

4．2 结果与分析

4．2．1 重组质粒pET-EGFP、pET-Pm-EGFP的构建

4．2．2 羟基对重组EGFP荧光的淬灭效应

4．2．3 羟基对胞内EGFP荧光的淬灭效应

4．3 讨论

第五章 抗白粉病基因Pm21的精细定位

5．1 实验材料及方法

5．1．1 生物材料

5．1．2 生物信息学分析

5．1．3 引物合成

5．1．4 基因组DNA的提取

5．1．5 PCR扩增与检测

5．1．6 多态性标记的缺失定位

5．1．7 DNA片段的克隆与测序

5．2 结果与分析

5．2．1 6VS标记在二穗短柄草基因组中的电子定位

5．2．2 已报道的6VS标记在簇毛麦中的缺失定位

5．2．3 低密度比较基因组图谱的构建

5．2．4 目标区二穗短柄草与水稻基因组的共线性分析

5．2．5 多态性CISP标记的筛选

5．2．6 簇毛麦DNA序列的进化分析

5．2．7 多态性CISP标记的缺失定位

5．2．8 目标区高密度比较基因组图谱的构建

5．3 讨论

第六章 Pm21候选基因的克隆与分析

6．1 实验材料及方法

6．1．1 生物材料

6．1．2 二穗短柄草R基因的鉴定

6．1．3 蛋白质结构域分析

6．1．4 基因簇分析

6．1．5 引物的设计(表6．1)

6．1．6 R基因片段的克隆

6．1．7 R基因片段的染色体定位分析

6．1．8 植物总RNA的提取

6．1．9 RT-PCR

6．1．10 TAIL-PCR

6．2 结果与分析

6．2．1 二穗短柄草全基因组R基因的鉴定与染色体分布

6．2．2 二穗短柄草全基因组R基因结构分析

6．2．3 二穗短柄草3BdS上的R基因

6．2．4 簇毛麦R基因片段的克隆与分析

6．2．5 簇毛麦R基因片段的染色体定位分析

6．2．6 Hv-R1基因的转录分析

6．2．7 Hv-R1基因内含子的鉴定

6．2．8 全长Hv-R1基因的克隆与分析

6．2．9 Hv-R1基因启动子分析

6．3 讨论

第七章 全文总结及展望

7．1 主要结论

7．2 工作展望

论文的主要创新点

参考文献

致谢

在学期间发表论文