甘蓝SRK激酶结构域编码区的克隆及其与MLPK的双色FISH定位研究

摘要

芸薹属自交不亲和性由S位点所控制。SRK基因是决定自交不亲和性反应的关键因子，前人已经从芸薹属中的甘蓝、甘蓝型油菜等物种中克隆出SRK基因。SRK基因的变异和表达量都会影响自交不亲和性。SRK基因的胞外域有着较大的多态性，变异常常发生在此编码区。相对于胞外域，激酶结构域的保守型较强。本文专门对SRK基因激酶结构域进行了克隆分析，以期从进化的角度探讨激酶结构域对于自交不亲和性的作用。除此之外，MLPK被证明也是SI反应中必不可少的一个因子，作为SRK下游元件起作用。本文针对这两个基因在SI中的重要性，利用FISH技术将SRK和MLPK进行物理定位，从而探索其在甘蓝基因组中的分布及其拷贝数。得到的主要研究结果如下：
　　 1.以结球甘蓝263、羽衣甘蓝AY627和甘蓝型油菜S11为材料，采用PCR、RT-PCR等技术，分别对SRK激酶结构域基因组DNA和cDNA进行了扩增、测序和序列分析，并构建了分子进化树。分别获得了1694bp和1307bp的片段、1705bp和1229bp的片段和1606bp和1214bp的片段，分别编码433，407和402个氨基酸。对获得的片段进行比对发现，结球甘蓝263包括5个外显子和4个内含子，羽衣甘蓝AY627和甘蓝型油菜S11包括6个外显子和5个内含子。并且发现结球甘蓝263的内含子少1个，并且有一段70bp左右的插入片段。对已报道的21种SRK基因和本文所克隆的3种材料的序列构建分子进化树，发现三者都与S单倍型的Ⅰ类SRK基因聚在一起，Ⅱ类基因与Ⅰ类基因分为两支，拟南芥与Ⅱ类聚在一起，而萝卜属未形成单独的一支。推导甘蓝26370bp片段的插入有可能是内含子转化而来并导致了自交不亲和性的产生。羽衣甘蓝AY627与甘蓝型油菜S11所获得的片段与预期一致，激酶结构域没有发生片段的插入或缺失，推导导致甘蓝型油菜S11自交不亲和性的原因没有发生在激酶结构域部分。通过进化树飞分析推导出萝卜属与芸薹属的分离晚于SILKⅠ类和Ⅱ类的分离。
　　 2.在FISH过程中，对甘蓝根尖前中期染色体和DNA纤维的制片进行了一些条件的改变，试图提高FISH效果。在前中期染色体制片中，本文对冷处理时间和酶解时间进行了改变，将冷处理时间定在20h，酶解时间定在90min，制得的染色体图片前中期分裂相较多，并且粘连程度较低，背景也较干净。在DNA纤维制片中，细胞核的提取过程中，控制研磨力度和加入TritonX-100的量进行了改变；DNA纤维制片时，改变了细胞核裂解液的裂解时间。通过以上改变，降低了纤维的缠绕程度。
　　 3.用经过以上改变条件后制得的片子进行FISH。通过对前中期染色体的FISH结果表明，能够分别检测出两种颜色的信号，但是其信号检测率不高，推导其原因是除染色体本身的质量外，探针的单拷贝和小片段特点也是影响其效果的原因，所以本实验只能将SRK和MIPK初步定义在第1号染色体和第3号染色体上。通过对DNA纤维时期的FISH结果，未能检测出明显信号，推测其原因，在制片的过程中，不能从其理化性质来判断其制片的好坏，导致了FISH不甚理想。