烟草曲茎病毒外壳蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备与检测应用

摘要

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒。双生病毒的外壳蛋白具有良好的抗原活性，通常制备一种病毒的多克隆抗体可用于检测同一亚组的其他成员。烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus，TbCSV)是双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的单组份病毒，在我国云南烟草和番茄上的危害十分严重。为了进一步了解TbCSV及Begomovirus属病毒在我国其它省市的发生和危害，以及为研究TbCSV与寄主的互作奠定基础，本论文进行了TbCSV外壳蛋白(Coat Protein)基因(CP)的克隆与原核表达，在制备多克隆抗体的基础上对田间采集的双生病毒病样品进行了PCR及ELISA检测。
　　 通过设计TbCSV CP基因的特异性引物PCR扩增并克隆到了大小为771 bp的TbCSV CP基因。利用原核表达载体pGEX-6P-1在大肠杆菌BL21(DE3)plus S中成功表达了融合谷胱甘肽标签的GST-CP，并鉴定其以包涵体形式存在。随后通过聚乙二醇20，000浓缩达到1 mg/ml的浓度。用纯化后的融合蛋白免疫家兔，获得了GST-CP的多克隆抗体。通过间接ELISA确定其效价约为1:10，000。Westernblot结果表明该多克隆抗体具有较高的特异性。
　　 分别利用双生病毒及TbCSV的特异性引物通过PCR技术检测采自四川攀枝花地区的75份赛葵样品，同时应用制备的TbCSV CP的多克隆抗体对这些样品进行了ELISA检测。ELISA检测结果表明，共有23份样品与TbCSV CP的多克隆抗体发生了阳性反应，其余为阴性。PCR扩增结果表明23份阳性样品含有双生病毒，其中检出4份样品感染了TbCSV。
　　 本研究成功获得TbCSV CP的原核表达产物，并利用所制备的TbCSV CP多克隆抗体对田间采集的赛葵样品进行ELISA检测，并与PCR检测结果进行对比。结果表明用TbCSV CP的原核表达产物制备的多克隆抗体不仅能够检测TbCSV，也能够用于检测Begomovirus属的其他病毒，今后可望用于Begomovirus属病毒田间样品的大量检测，且进一步证明该属病毒成员之间具有较近的血清学关系。同时检测结果也表明，目前双生病毒在四川攀枝花及邻近地区已有发生，虽然TbCSV检出率不高，目前还不是该地区Begomovirus属病毒的优势种，但鉴于该病毒已在云南烟草及番茄上造成严重危害，其在四川进一步危害的趋势值得高度关注。