竹节参离体培养与鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的克隆及代谢研究

摘要

竹节参(Panax japonicus C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物,是我国珍稀濒危的名贵“七类”中草药之一,被誉为“草药之王”,具有南药三七活血化瘀和北药人参滋补强壮之功效,有抗炎镇痛、免疫调节、抗心肌缺血、降血糖、抗衰老、抗疲劳、抗癌和改善学习记忆功能等多种生物活性。近年来,由于竹节参具有多种药理作用而广泛运用于临床,导致其需求量增大,野生资源遭到严重破坏,因此,仅仅依靠野生原料药的供应,在数量和质量上都很难以满足国内医药市场的需要。同时,外商也纷纷要求从中国订购竹节参三萜皂苷以开发口服液、胶囊、复方含片等产品,从而导致其价格一路走高。
　　 为解决竹节参产业化发展的技术瓶颈,我们开展了以种子萌发为基础的组织培养和植株再生体系研究,以满足药农对竹节参种苗的需求。同时开展了竹节参的毛状根培养研究,以寻求一种既不破坏野生竹节参植物资源又能获取三萜皂苷的生产方式,以满足医药市场对竹节参三萜皂苷的需求。为了搞清竹节参中三萜皂苷生物合成途径,我们克隆了该途径上关键酶(Squalene Synthase,SS)基因,通过转基因技术在烟草中验证了其功能,为将来对竹节参高产三萜皂苷进行遗传改良奠定了理论基础。最后我们建立了竹节参根中总皂苷和5中人参皂苷单体的测试方法,并就其动态变化规律进行了分析,为竹节参毛状根培养和SS基因在烟草中的功能验证等实验中有关竹节参皂苷的检查提供了基本方法。本论文主要研究结果如下:
　　 1.通过单因素试验和正交试验以筛选竹节参种子萌发的优化组合参数
　　 单因素试验结果指出,竹节参种子萌发的最适GA3浓度、浸种温度、浸种时间为150 mg·L-1、25℃、24h;与此相对应的萌发率依次为95％,90％,90％。正交试验指出,竹节参种子萌发率的优化组合为A2B2C2,即GA3浓度为150 mg·L-1,浸种时间为24h,浸种温度为25℃;萌发指数的优化组合为A2B2C3,即GA3浓度为150 mg·L-1,浸种时间为24 h,浸种温度为30℃。
　　 2.竹节参组织培养及其再生体系的建立
　　 以MS培养基为基本培养基,竹节参外植体(茎)在0.05 mg·L-1NAA+2mg·L-1 ZT时,不定芽再生率为96.3％;0.05 mg·L-1NAA+1.5 mg·L-1ZT的激素配比能显著提高不定芽的增值,增值系数为9.16;在1/2MS+2 mg·L-1NAA的生根培养基上进行生根培养,生根率为86.4％。
　　 3.竹节参毛状根培养体系的建立及其次生代谢产物分析
　　 发根农杆菌C58C1能诱导竹节参产生毛状根,浸染25min,诱导率最高(90％);共培养4d,诱导率最大(86.9％)。在竹节参毛状根培养过程中发现,高浓度的NAA和IAA对竹节参毛状根生物量的积累有抑制作用;而IBA只有在1mg·L-1时才有促进作用。竹节参毛状根培养到6周时生物量的积累达到较为理想状态,此后随着时间推移,积累效果不明显。
　　 HPLC和紫外风光光度法检测表明,竹节参毛状根人参皂苷的合成可划分为启动期、指数增长期、稳定平衡期3个阶段。启动期一般在1～2周;指数生长期一般在2～6周(7周或8周);在稳定平衡期,人参皂苷含量增加幅度较小、甚至极小。在所有的竹节参毛状根单克隆系中,总皂苷含量动态变化规律是PJg＞PJ8＞PJ7＞PJ6＞PJ2＞PJ4＞PJ1＞PJ5＞PJ3。除PJ3和PJ5毛状根单克隆系外,与人参皂苷Rg1、Rg2、Rh1和Rh2相比,Re在其它7个单克隆系中,合成能力最强、合成速度最快,含量最高,为竹节参毛状根培养的代表性物质。在含量层面,同五年生竹节参根相比较,培养九周的竹节参毛状根,其最大含量的总皂苷(PJ9)、Re(PJ8)、Rg1(PJ7)、Rg2(PJ3)、Rh1(PJ9)、Rh2(PJ6)分别提高13倍、7.5倍、13.8倍、28.9倍、29.9倍、43.8倍。
　　 GC-MS分析指出,竹节参根和毛状根精油含量分别为0.45％和0.38％。在竹节参根精油中共检出40种化合物,竹节参毛状根中则检出45种,其中18种化合物为两者所共有,相对含量之和分别是59.30％和59.84％。竹节参根精油中的代表性物质为正己酸(11.6％),镰叶芹醇(10.04％)和3-甲基丁酸(9.56％);竹节参毛状根中的代表性物质为则正己酸(13.92％)、匙叶桉油烯醇(9.96％),1aR-(1aα,4α,4aβ,7bα)-1a,2,3,4,4a,5,6,7b-八氢-1,1,4,7-四甲基-1H-环丙烯并奥(9.15％)。
　　 4.竹节参鲨烯合酶(Squalene Synthase,SS)基因的克隆及其在烟草中的功能验证利用RACE技术成功克隆了竹节参三萜皂苷合成途径上的关键酶(鲨烯合酶)基因SS,其大小片段为1353 bp,包括45 bp的5'-UTR,60 bp的3'-UTR和1248bp的ORF。整个ORF编码415个氨基酸,分子质量为109559.7 kD,分子式为C4054H6790N1320O1706S257,为疏水性蛋白质。生物信息学分析指出SS基因定位于叶绿体(cTP)、线粒体(mTP)和分泌途径(SP);SS氨基酸有两个跨膜结构域和八个motif结构位点;SS二级结构由α-螺旋、无规卷曲、延伸链、β-转角组成,其百分比依次为67.47％、22.41％、7.23％和2.89％。
　　 成功构建SS基因的正、反义植物表达载体pCXSN-PjSS和pCXSN-antiPjSS,运用农杆菌LBA4404转化烟草。PCR检测表明,目的基因PjSS和antiPjSS以及潮霉素抗性基因Hyg均整合到烟草植株中;RT-PCR扩增指出,PjSS已经在烟草中转录为mRNA,并得到超量表达,而antiPjSS则抑制其表达。对人参皂苷Re含量测定表明,SS正义转基因烟草能提高人参皂苷Re的含量,SS反义转基因烟草则相反。
　　 5.竹节参根皂苷的提取工艺及其含量检测方法的建立
　　 正交试验结果指出,竹节参根总皂苷的提取工艺为A2B2C1,即材液比为1:10,甲醇浓度为65％,提取温度为50℃。用紫外分光光度法检测竹节参根中的总皂苷,以香草醛-高氯酸-冰醋酸-甲醇为显色体系,在波长560 nm时,建立回归方程为y=0.4024x+0.0043,R2=0.9999,线性范围为0.5μL·mL-1～2.5μL·mL-1。重现性、稳定性、精密度和加样回收率均小于5％,在所控范围之内,说明实验重现性和稳定性好,精密度和加样回收率高,可用于竹节参总皂苷含量的测定。用HPLC进行检测竹节参根中的5种人参皂苷单体Re、Rg1、Rg2、Rh1和Rh2,在波长203 nm下,建立线性回归方程依次为,y=42.08x+24.25、y=52.23x+43.87、y=40.09x+3.51、y=115.36x+32.41、y=98.46x+30.52,其线性范围和相关系数分别在0.18μg～15.45μg和0.996～0.998之间。重现性、稳定性、精密度和加样回收率试验指出,其相对标准偏差(RSD)均小于5％,在所控范围之内,符合样品测试要求。
　　 含量动态变化分析指出,随着生长年限的增加,竹节参总皂苷含量逐步增加,其中一年生到四年生含量变化幅度较大,变幅超过50％,四年生到五年生相对较小,仅为9％,五年生竹节参根中总皂苷达到最大值,为87.2 mg·g-1。在每一年的不同时期,其含量变化规律是枯萎期＞果期＞花期＞营养生长期。因此,以根为药材,一般选择四年生的竹节参,在枯萎期采收较为合适。同理,5种人参皂苷含量随着生长年限的增加而增加,在五年生竹节参根中均达到最大值,其中Re、Rg1、Rg2和Rh1含量最大值均在枯萎期,分别为7.86mg·g-1、3.02 mg·g-1、1.47 mg·g-1和1.72 mg·g-1,而Rh2出现在果期,为1.24 mg·g-1。和其它4种人参皂苷单体相比较,Re含量均处于较高水平,可见人参皂苷Re为竹节参根的标志性产物。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1 前言

1.2 形态及其生物学特性

1.3 名称考证与民间应用

1.4 化学成分

1.4.1 皂苷类物质

1.4.2 酸类与糖类

1.4.3 其它类物质

1.5 生物活性及其在医药上的应用

1.6 繁殖与栽培管理

1.7 产业化发展前景

1.7.1 产业发展急需解决的问题

1.7.2 在光合作用与生物量积累层面

1.7.3 在引种驯化与繁殖技术层面

1.7.4 在皂苷成分层面

参考文献

第二章 竹节参种子萌发试验与无菌快繁体系的建立

2.1 引言

2.2 研究目的与意义

2.3 研究内容与技术路线

2.4 仪器与试剂

2.5 材料与方法

2.5.1 实验材料

2.5.2 试验方法

2.6 结果与分析

2.6.1 竹节参种子萌发试验

2.6.2 竹节参组织快繁

2.7 本章小结

参考文献

第三章 竹节参毛状根培养及其次生代谢产物分析

3.1 前言

3.2 研究目的与意义

3.3 研究内容与技术路线

3.4 试剂与仪器

3.4.1 菌株

3.4.2 试剂与培养基

3.4.3 仪器

3.5 实验方法

3.5.1 C58C1菌种保存与活化

3.5.2 毛状根的诱导

3.5.3 培养时间和植物生长调节物质对竹节参毛状根生物量积累的影响.

3.5.4 转化毛状根的PCR检查

3.5.5 转化根皂苷含量测定

3.5.6 转化根与非转化根精油成分的测定方法

3.6 结果与分析

3.6.1 浸染时间对竹节参毛状根诱导的影响

3.6.2 共培养时间对竹节参毛状根诱导的影响

3.6.3 植物生长调节物质对竹节参毛状根生物量积累的影响

3.6.4 培养时间对竹节参毛状根生物量积累的影响

3.6.5 竹节参毛状根中rolB基因的PCR扩增

3.6.6 竹节参毛状根中人参皂苷的含量

3.6.7 竹节参毛状根中人参皂苷含量动态变化规律

3.6.8 竹节参毛状根与非转化根精油成分

3.7 本章小结

参考文献

第四章 竹节参鲨烯合酶(Squalene Synthase,SS)基因的克隆及其在烟草中的功能验证

4.1 前言

4.2 研究目的与意义

4.3 研究内容与技术路线

4.4 实验仪器与试剂

4.4.1 实验仪器

4.4.2 试剂

4.5 实验方法

4.5.1 竹节参总RNA的提取

4.5.2 RNA的检测

4.5.3 竹节参总RNA合成cDNA

4.5.4 竹节参SS基因核心片段的克隆

4.5.5 竹节参SS基因3'端片段的克隆

4.5.6 竹节参SS基因5'端片段的克隆

4.5.7 竹节参SS全长cDNA的克隆

4.5.8 SS基因植物表达载体的构建及转化烟草

4.6 结果与分析

4.6.1 竹节参RNA的提取与质量检测

4.6.2 竹节参SS基因的克隆

4.6.3 竹节参SS基因的生物信息学分析

4.6.4 竹节参SS基因正、反义植物表达载体的构建及工程菌的获得

4.6.5 竹节参SS基因转化烟草及其检测

4.7 本章小结

参考文献

第五章 竹节参根中人参皂苷分析方法的建立及含量积累

5.1 前言

5.2 研究内容与技术路线

5.3 仪器与试剂

5.4 实验方法

5.4.1 竹节参根中皂苷提取方法筛选

5.4.2 总皂苷测定方法

5.4.3 单体人参皂苷的测定方法

5.5 结果与分析

5.5.1 竹节参根中总皂苷提取工艺

5.5.2 总皂苷测定方法考察结果

5.5.3 单体人参皂苷测定方法考察结果

5.5.4 竹节参根皂苷含量动态变化规律

5.6 本章小结

参考文献

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 特色与创新

6.3 展望

致谢

在学期间发表论文及参加课题