结核分枝杆菌哺乳动物细胞入侵因子mce家族Rv0590A基因的性质及功能研究

摘要

结核病是一种严重危害人类健康的传染病，它是由结核分枝杆菌(Mvcobacterium tuberculosis)引起的一种慢性疾病。结核病发病率的增加在一些资源短缺国家甚至工业发达国家都已是不争的事实。人们对(Mycobacteriumtuberculosis)的生物特性进行广泛研究，研发了链霉素、异烟肼、利福平等治疗性药物，使得人类对结核病的控制取得了可喜的成绩。然而，化学药物的不合理应用，耐药菌株的广泛出现，M.tuberculosis与人类免疫缺陷病毒HIV的共感染，人口流动的增加使得结核病疫情下降缓慢，在部分地区甚至有所回升。开发出对结核病有效的预防性、治疗性疫苗和新型药物是亟待解决的难题。寻找新的结核药物作用靶点和开发新型抗结核药物己成为当前最受关注的热点。
　　 M.tuberculosis作为一种胞内致病菌，主要存在于单核吞噬细胞内。它的一个重要特征是能够在宿主巨噬细胞内存活和增殖，并抑制吞噬小体的酸化和成熟。M.tuberculosis的基因组包含4个哺乳动物细胞入侵因子(mce)操纵子(mcel-4)，每个mce操纵子含有8-13个基因，它们相互毗连且在各操纵子中排列相似。每个操纵子中相对应的基因具有相似的序列及有机组成，编码与M.tuberculosis入侵以及在宿主巨噬细胞中存活相关的输出蛋白。mce基因使得重组非致病菌E.coli能够入侵哺乳动物并在其巨噬细胞中存活，与M.tuberculosis入侵宿主细胞并在其巨噬细胞内的持久存活有着密切的关系。Rv0590A作为mce操纵子上一个未知功能的ORF，是mce2操纵子上一个独有的基因，可能与Mce2R共同调控mce2的表达。Rv0590A与mce2B组成M.tuberculosis H37Rv的一个中断编码序列(ICDS)，与其他18个ICDS共同构成M.tuberculosis和Mycobacterium bovis(M.boris)分化的依据之一。
　　 本研究通过生物信息学对结核分枝杆菌H37Rv的Rv0590A基因的性质及功能进行研究，并对该基因编码蛋白的结构和功能进行分析和预测，以期为该蛋白的研究提供生物信息学相关的参考依据。运用TMHMM Serverv.2.0，Jpred，VectorNTI9，Clustal X，SignalP，swiss model等生物信息学资源对Rv0590A的基本性质进行了分析，包括对蛋白一级结构(亲水性/疏水性，跨膜结构和信号肽等)，二级结构以及三级结构等基本性质的预测分析。结果表明：结核分枝杆菌H37RvRv0590A编码蛋白无信号肽，不存在跨膜结构区；其二级结构是由2个α螺旋及2个β折叠片构成。同时在一、二级结构分析的基础上，利用同源建模的方法完成了其三维结构的建模。运用http：//string.embl.de/软件预测Rv0590A蛋白相互作用网络，结果表明与其相互作用蛋白主要是同源及与其毗邻的蛋白即mce2操纵子所编码的蛋白及其调节子Rv0586。与报道的Rv0590A可能与Rv0586共同调节mce2的转录相互印证。利用比较基因组学分析该蛋白在分枝杆菌属中的同源和分布情况，结果表明该基因在进化上相对保守。
　　 从GenBank数据库中获得结核分枝杆菌H37Rv的Rv0590A基因的核苷酸序列，设计两对引物，分别以结核分枝杆菌H37Rv全基因组为模板，分别体外扩增获得Rv0590A基因。分别通过TA克隆，将PCR产物连接到pMD19-T SimpleVector，分别亚克隆至载体pET28a(+)和pcDNA3.1(+)中，经菌落PCR以及序列测定证明成功构建了重组质粒pET28/Rv0590A和pcDNA3.1/Rv0590A。将重组质粒pET28/Rv0590A转化Escherichia coli BL21(DE3)，对该重组蛋白质进行诱导表达。扩大培养后，采用Ni+凝胶亲和层析方法纯化获得高纯度的重组Rv0590A蛋白，weaern bloting验证Rv0590A融合表达。我们研究了过表达该蛋白对宿主菌的影响，包括过表达Rv0590A对宿主菌生长，脂肪酸组成以及对宿主菌抗氧化压力的耐受性研究。将重组pcDNA3.1/Rv0590A转染真核细胞U937，转录水平上检测到Rv0590A的表达及Rv0590A对于U937的转染所引起的细胞因子表达量的变化。本研究为揭示结核分枝杆菌Rv0590A的生理功能及其对mce2操纵子的特殊作用以及Mce家族的作用机制提供线索。