苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)人工繁育和势胁迫适应性研究

摘要

苹果蠹蛾cydia pomonella(L)是世界性的重要检疫性害虫，以幼虫蛀食危害苹果、梨、桃、沙果等仁果，导致果实品质下降和产量剧减，造成巨大的经济损失。苹果蠹蛾起源于欧亚大陆中南部地区，目前随苹果品种的分布扩展危害到世界上除东亚以外的所有苹果和梨产地。苹果蠹蛾20世纪50年代发生在我国新疆库尔勒地区，其后逐渐向内地扩散，目前已扩至甘肃敦煌、酒泉与张掖。也有报道称在内蒙古和宁夏等地零星发生，这表明苹果蠹蛾已穿过河西走廊向苹果主产区扩散，形势十分严峻。进一步的扩散与暴发将严重威胁我国水果优势产区的果业生产。
　　 由于国内对苹果蠹蛾的研究近年来才受到广泛重视，以往的许多研究大多集中在野外监测和综合防治；对苹果蠹蛾的发生规律、生态适应性、扩散与扩张机制等方面的研究明显不足，基础研究十分薄弱。
　　 本论文在开发利用人工饲料大量繁殖苹果蠹蛾的技术基础上，围绕苹果蠹蛾实验种群的生态适应性这一科学问题，重点研究了：(1)不同人工饲料对苹果蠹蛾实验种群生长发育的影响；(2)苹果蠹蛾实验种群成虫飞行能力与幼虫耐饥能力；(3)苹果蠹蛾实验种群的热适应性与分子响应机制。通过上述研究，以期明确苹果蠹蛾在扩散与扩张过程中的行为特征与生态适应能力；在理论上初步阐明其扩散与扩张的机制，在实践上为制定合理的检疫处理和防控措施提供依据。主要研究结果如下：
　　 1、不同人工饲料对苹果蠹蛾实验种群生长发育的影响
　　 在参考国外苹果蠹蛾人工饲料配方的基础上，改进了胚芽苹果粉法、小麦胚芽法和斑豆法三种人工饲料的配方，建立了健康的实验室种群。利用人工饲料繁殖14代苹果蠹蛾，其生殖(如产卵量)与发育(蛹重、卵孵化率)特性等均保持在较高水平，如单雌产卵量保持在124.2～143.2粒/雌，与田间统计的雌虫最高产卵量140粒左右相近，孵化率也稳定保持在78.0～88.5％。其中以改进的胚芽苹果粉法饲养的昆虫种群的质量最高，种群的生殖潜能和繁殖趋势最好。在27℃条件下，利用斑豆法人工饲养的实验种群，其种群内禀增长率(rm)、周限增长率(λ)、净生殖力(R0)、平均代时(T)分别为0.085雌/雌/天、1.09、43个后代/个体和44.6天，表明普通人工饲料上的种群趋势亦很好。
　　 2、苹果蠹蛾实验种群成虫飞行与幼虫耐饥能力
　　 飞行磨吊飞研究证实了苹果蠹蛾有较强的飞行能力。雌雄成虫在16 h的吊飞过程中累计飞行距离分别为12.16 km和10.58 km。雌雄成虫飞行距离超过10 km的个体分别占种群的58.3％和37.5％。不同龄期的幼虫耐饥能力研究表明：1-5龄幼虫的饥饿耐受总时长分别为44.7、73.4、141.2、194.8和203.6 h。耐受总时长随龄期的增长显著性延长，4龄和5龄幼虫的耐受能力显著高于低龄幼虫。成虫阶段不补充营养，对雌虫的寿命和生殖影响不显著。这些研究结果表明无论是苹果蠹蛾成虫还是幼虫，都具有较强的扩散和转移危害的能力。
　　 3、苹果蠹蛾实验种群的热适应性
　　 卵和各龄幼虫的高温耐受阈值研究结果表明：卵在48℃和50℃分别处理2、5和10 min，死亡率随温度梯度上升死亡率显著升高，50℃处理能显著降低卵的存活率，时间超过5 min卵全部死亡。1-5龄幼虫在50℃和52℃高温条件分别处理2、5和10 min，3龄幼虫耐热性最差，5龄幼虫最强。50℃处理10 min和52℃处理5min均可导致1～4龄幼虫全部死亡，而5龄幼虫在这两种处理下存活率仍有25.0％和11.1％。52℃处理超过10 min才能使5龄幼虫全部致死。说明5龄幼虫耐受极端高温的能力最强。
　　 高温胁迫对5龄幼虫生殖适合度的影响研究结果表明：32℃～44℃处理3 h，不会显著降低5龄幼虫存活率，44℃高温处理3 h仍高达91.5％。而且化蛹率和雌成虫寿命在32～38℃胁迫范围内均不受显著性影响。但经过38℃以上高温胁迫长于3 h的幼虫羽化而来的成虫寿命和单雌产卵量均显著性降低。可能5龄幼虫以较高存活率的形势所表现出的高温适应特性，与其生殖适合度付出的代价之间存在某种均衡。
　　 4、苹果蠹蛾热适应性的分子响应机制
　　 1)、热激基因家族的克隆和序列分析
　　 利用热激基因家族的保守特性，应用兼并引物进行同源克隆，结合RACE技术，从胁迫温度处理的苹果蠹蛾5龄雌虫体内成功克隆得到1个hsp90基因和2个hsp70基因，分别命名为Cphsp90、Cphsp70-1和Cphsp70-2。对以上三种热激基因cDNA全长开放性阅读框(ORF)和预测分子量等序列信息进行了分析，其末尾基序“MEEVD”或“EEVD”表明均为胞质热激蛋白，其推导氨基酸序列与其他物种相应基因家族的最高相似性分别为96％、90％和87％。苹果蠹蛾CpHsp90与蛀果蛾科的桃蛀果蛾Carposina sasakii亲缘关系最近，CpHsp70-1和CpHsp70-2与小菜蛾Plutella xylostella亲缘关系最近。
　　 2)、苹果蠹蛾Cphsp90和Cphsp70 mRNA的响应模式
　　 采用RT-qPCR技术，以苹果蠹蛾actin为内参基因，分别测定了实验种群5龄雌幼虫Cphsp90、Cphsp70-1和Cphsp70-2在低温、高温胁迫和短时热驯化过程中的相对表达水平，结果表明：(1)4～25℃的低温胁迫1 h后，Cphsp90和Cphsp70-1mRNA在低温胁迫下均在4℃显著性上调表达，但Cphsp70-2 mRNA随低温胁迫程度升高而下调，低温响应不显著。(2)32～44℃高温胁迫1 h后，Cphsp90、Cphsp70-1和Cphsp70-2 mRNA相对表达量均显著性上调表达，分别为对照的12倍、50倍和80倍，说明三者在抵御高温胁迫方面发挥重要作用。
　　 3)、苹果蠹蛾不同发育阶段和不同组织热激基因的相对表达模式
　　 (1)分别测定常温条件下苹果蠹蛾卵、1～5龄幼虫、蛹和成虫三种热激基因的相对表达量，结果显示不同发育阶段两个hsp70基因的表达具有显著性差异，3龄和4龄幼虫相对表达量低，且显著低于其他生活史阶段，初步认为这两个基因是发育性调节的，3～4龄中低水平表达或不表达，其他阶段差异不显著或高水平表达。这与3龄幼虫的耐热性最差的结论相符。35℃热处理后各发育阶段热激基因的调节水平发生显著性变化，卵、1～2龄、5龄和成虫的三种热激基因均在温度胁迫条件下发生显著性上调表达。(2)分别测定苹果蠹蛾常温条件下血淋巴、中肠、脂肪和表皮中三种热激基因的相对表达量，结果显示不同组织中三种热激基因的表达具有显著性差异，Cphsp90在中肠和脂肪体中相对表达量最高，Cphsp70-1和Cphsp70-2均在表皮最高。35℃热处理1 h后，表皮中三种热激基因的表达量均显著上调，并显著高于中肠和脂肪体，证明表皮是热激基因mRNA表达最活跃的调节组织，这可能是昆虫在温度变化环境中表皮的一种热适应机制。
　　 4)、热激基因在苹果蠹蛾滞育及其耐热性的相关性
　　 苹果蠹蛾5龄滞育幼虫的耐高温能力强于非滞育幼虫，滞育的形成过程也伴随着耐高温能力的增强。研究采用自然胁迫下的越冬幼虫和人工诱导条件下滞育幼虫，平行研究了不同胁迫条件诱导的滞育过程中热激基因的协调表达水平。结果表明越冬滞育进程中Cphsp70-1上调表达响应，人工诱导的滞育过程中Cphsp90上调表达响应，而Cphsp70-2在两种不同胁迫条件诱导的滞育进程中均下调表达。结果表明不同胁迫条件诱导的滞育过程中参与协调响应的热激基因成员不同。但是Cphsp90、Cphsp70-1和Cphsp70-2都参与了滞育幼虫的耐热性响应，均在32～44℃温度范围内发生响应性上调表达以发挥保护作用。热激基因参与滞育的协调响应表达，可能是滞育幼虫耐热性增强的主要原因。
　　 5)、不同环境波动条件下，幼虫耐热可塑性机制
　　 针对环境中温度波动或温热预处理会显著增强苹果蠹蛾5龄幼虫在极端高温下的耐受性问题，研究采用经历温度波动不同的恒温饲养幼虫、越冬幼虫和人工诱导滞育幼虫为材料，分别进行35℃温热3 h短时热驯化，以不作驯化直接高温胁迫的昆虫为对照，检测耐热可塑性形成过程中三种热激基因的相对表达水平。研究结果显示以上三种经历不同温度波动的5龄雌幼虫经温热预处理后，在更高温度胁迫条件下Cphsp90达到最高表达量的胁迫温度均比未预热直接高温胁迫的昆虫提升了一个温度梯度或至少是同等温度。表明苹果蠹蛾5龄幼虫的耐热可塑性与Cphsp90的响应性协调表达密切相关，不受昆虫之前所经历的温度波动的影响，调节模式稳定。但是两种Cphsp70基因的表达水平却依昆虫是否经过低温诱导形成滞育而发生了变化，恒温饲养种群温热后更高温度胁迫下Cphsp70-1和Cphsp70-2的表达受到抑制，但是在滞育幼虫体内却参与上调响应。说明两种Cphsp70参与的响应表达可能是苹果蠹蛾滞育幼虫在温度变化中形成更高耐热性的一个重要原因。
　　 本研究的创新点在于：
　　 (1)首次在国内建立了人工饲料大规模实验苹果蠹蛾的技术与方法，实现连续多代饲养。
　　 (2)首次阐明了苹果蠹蛾飞行能力与幼虫的耐饥饿能力。
　　 (3)鉴定了我国苹果蠹蛾实验种群的耐高温阈值，并研究了高温胁迫对生殖适合性的影响。
　　 (4)研究针对温度波动可能导致苹果蠹蛾耐热性增强的科学问题，从热激蛋白转录水水平上解析了他们在该虫耐热的阶段性差异和耐受可塑性方面的重要作用。