不同血清型沙眼衣原体鼠生殖道感染模型的建立与侵袭力研究

摘要

目的:
　　 1.建立临床沙眼衣原体细胞培养方法。
　　 2.建立临床常见血清型C.t的小鼠生殖道感染模型。
　　 3.监测小鼠阴道清除C.tE、F、J、K四个血清型时间，并在有限时间内初步了解小鼠初次、再次感染C.t血清型后清除时间的长短，侵袭上生殖道的情况，了解型别间毒力的差异。
　　 方法:
　　 1.收集C.t临床标本培养鉴定并测序分型，得到临床常见的C.t四个血清型临床型株，在细胞培养的基础上通过多种方法提高C.t培养的感染率，然后用高速离心提纯C.t EB并通过计数来定量(IFU/ml)包涵体数。
　　 2.选择6～7周龄性成熟BALB/C雌性小鼠20只，随机分5组，每组5只。孕酮处理的小鼠，于接种前10d、3d皮下注射醋酸甲羟孕酮以增加小鼠对C.t感染的敏感性，预处理后用107IFU/ml数量级的C.t感染液接种小鼠。接种后第四天，取阴道一宫颈口拭子分泌物做PCR、衣原体单克隆抗体免疫荧光、分离培养来证实感染的存在。
　　 3.44只小鼠分4组每组11只，用E、F、J、K四型C.t用相同方法感染四组小鼠，于接种后第4.7.10.14.17.21.24天取小鼠阴道分泌物，用上述三种方法监测阳性持续的时间，第一次接种C.t后35天，每组处死小鼠5只。剩下的每组6只，在第一次接种后二个月再次以相同的方式剂量感染小鼠，相同方式监测阳性持续时间，于接种后35天全部处死。
　　 4.二次杀小鼠后生殖道立即保存液氮，在液氮中研磨子宫组织提取DNA，通过质粒PCR方法来检测小鼠子宫感染C.t的情况。
　　 结果:
　　 1.C.t四型临床株成功培养并测序鉴定出E、F、J、K四个型别，通过传代培养收集到高浓度的C.t悬液，定量稀释后得到四个型别的浓度在(4.8～7.5)×107IFU/ml C.t EB悬液。
　　 2.小鼠C.t生殖道感染模型建立，接种后第四天用三种实验方法检测小鼠分泌物均证实感染率为100％：
　　 (1)小鼠分泌物提C.t质粒DNA做荧光PCR，可见分泌物标本与阳性质控品一样扩增阳性，证实阴道分泌物C.t感染的存在。
　　 (2)衣原体单克隆抗体免疫荧光显示小鼠阴道分泌物内可见针尖大小中-强等度苹果绿色EB荧光。
　　 (3)小鼠阴道分泌物C.t培养物碘染色可观察到C.t棕褐色的包涵体。
　　 3.建立四个临床型别的C.t模型后，三种方法证实初次感染持续感染时间在10-20天之间，再次感染持续的时间在7-14天之间，用生存分析法检验初次和再次感染持续时间型别间无统计学差异，初次感染E、F、J、K生存的中位数时间分别14天、10天、10天、10天；再次感染E、F、J、K生存的中位数时间都为7天。用二个相关样本秩和检验初次和再次感染C.t的相同型别鼠持续时间上有统计学的差异。
　　 4.取小鼠上生殖道子宫做PCR，证实四个型均有C.t侵袭到上生殖道，每组11例鼠中，K、E型各有4只侵袭到子宫，而J、F型各只有1只侵袭到子宫。用X2检验型别间无出统计学差异。
　　 结论:
　　 1.成功培养并鉴定出C.t临床株的E、F、J、K血清型。
　　 2.国内首次成功建立临床株C.t小鼠生殖道感染模型。
　　 3.建立E、F、J、K四型小鼠模型成功后，监测C.t感染后的自然清除时间较短，感染程度较轻，这与C.t感染人类的过程很类同。
　　 4.不同型别C.t上行到上生殖道子宫部位感染率不同，要证实侵袭力的差异性尚待进一步扩大样本量观察。