CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞影响的研究

摘要

瘢痕疙瘩是整形外科常见疾病之一,也是尚未解决的问题之一,治疗效果多年来没有显著的提高。瘢痕疙瘩的发生具有明显的个体差异和家族倾向,生物学特性十分复杂,其根本形成机制迄今尚未清楚,是整形外科重要的基础研究之一。大量的遗传流行病学研究和分子遗传学研究均表明瘢痕疙瘩的形成与相关遗传基因的表达异常具有非常密切的关系。既往研究显示,1号染色体的短臂术端汇集了许多与细胞生长,增殖,分化相关的基因,已有大量报道在许多肿瘤中该区存在缺失,其缺失频率位于36％～80%之间。寻找相关调控基因在瘢痕疙瘩发病机制中的作用已成为当前瘢痕疙瘩研究的热点之一[1]。因此深入研究以期从基因水平阐明瘢痕疙瘩的发病机制,筛选出瘢痕疙瘩形成或抑制的相关调控基因,为瘢痕疙瘩发病机理研究和指导临床有效的预防与治疗提供线索和依据,具有十分显著的现实意义。
　　 CDC2L1基因是编码p34Cdc2蛋白激酶家族中的一员。p34Cdc2蛋白激酶家族成员众所周知调控真核细胞周期的要素。CDC2L1基因与CDC2L2基因紧密相邻,在同一染色体相同区域上[2,3]。这个基因位点包括CDC2L1基因,CDC2L2基因及金属蛋白酶MMP21/22,构成一个大的重复基因组两个相同串联连接区域的一部分。CDC2L1基因和CDC2L2基因在神经母细胞瘤与扩增的MYCN基因表现为很高的缺失率或者变异率[4]。在细胞凋亡中,CDC2L1基因编码的蛋白激酶能够被caspase切割开和被修饰而发挥作用[5-11]。CDC2L1基因的几个可选择的剪接变体已经被报告。CDC2L1基因在维持细胞的细胞周期控制,凋亡,神经生理学,分化和转录过程中具有重要的功能,通过抑制CDC2Ll基因活性来达到研究CDC2L1基因在瘢痕疙瘩形成中的作用已成为瘢痕疙瘩基因研究的热点[12]。目前研究认为CDC2L1基因表达2种蛋白p58和p110,其中最重要的部分是p58蛋白,对CDC2L1基因发挥其功能是必不可少的,它也可以作为CDC2L1基因活性抑制剂的天然靶位[13]。靶向hCR常用的方法有RNA干扰(RNAi)、反义核苷酸技术封闭、锤头状核酶切割等。其中小干扰RNA(siRNA)更是在哺乳动物细胞中显示了强大的、有效的RNA干扰能力,因而化学合成的21-23核昔酸的siRNA或质粒表达的小发夹RNA(shRNA)被常规用于基因沉默研究。科研人员利用脂质体介导的细胞内shRNA表达技术,该shRNAs在体内再被加工为siRNAs,这种方式有可能导致有效的、长期的基因沉默。表达shRNA的质粒载体J下被广泛用于抗病毒、抗肿瘤和神经系统疾病的研究。脂质体最常用于体外细胞的转染,以后又被用做基因体内导入的载体。脂质体可以与DNA形成复合物,保护DNA不被核酸酶降解,与细胞膜结合后形成内吞小体,把DNA释放到细胞浆。脂质体由脂质双分子层组成的封闭囊泡,无毒和无免疫原性,因此成为基因治疗、RNAi分子递送的重要工具,广泛受到学者的青睐。
　　 国外研究CDC2L1基因时,所选的对象是肿瘤患者或实验动物,没有发现在瘢痕疙瘩方面的研究。所采取的研究方法多是RT-PCR,SNP分析,基因芯片检测技术,分子杂交技术,单链构象多态性分析,比较基因组杂交。国内虽然有研究CDC2L1基因在瘢痕疙瘩中的作用,所采用的技术是比较基因组杂交技术(CGH),变性高效液相色谱法结合测序筛选和鉴定,但由于研究时涉及到多个基因的作用及相互作用,不能体现其中一个基因在瘢痕疙瘩中的作用。鉴于上述原因,本课题选择利用基因治疗策略及方法来研究单个相关基因(CDC2L1)在瘢痕疙瘩发病机制所起的作用及其意义。
　　 研究目的：
　　 我们运用pGPU6/GFP/Neo siRNAExpression Vector构建重组质粒,利用脂质体转染来沉默瘢痕疙瘩成纤维细胞中的hCR基因表达,以观察CDC2L1基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的影响,为研究CDC2L1基因在瘢痕疙瘩中的作用提供可靠的依据和有效的手段。
　　 研究方法：
　　 1 CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达水平的测定
　　 通过q-PCR检测瘢痕疙瘩成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞中CDC2L1基因的mRNA表达水平。
　　 2 RNAi重组质粒的构建
　　 穿梭质粒的构建利用GenePharma公司的siRNA靶序列分析软件设计siRNA靶序列,再根据siRNA设计原则,选择针对hCR(GenBank number984)的21nt的序列(CDC2L1-1636,CDC2L1-1813,CDC2L1-1962位碱基)作为特异性siRNA靶序列。化学合成62nt寡核苷酸和它的互补链,退火、连接到BamH1/Bbs I线性化的pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector,构建重组穿梭质粒pGPU6-hCR。插入序列采用Bbsl和Pstl酶切和测序的方法来证实。siRNA的阴性和阳性对照寡核营酸被用来构建pGPU6-shNC,pGPU6-shhGAPDH,,构建方法同hCR。该质粒也用酶切和测序的方法证实。
　　 3筛选有效的干扰质粒
　　 通过q-PCR检测所构建的重组质粒对CDC2L1基因的抑制效率,从而选择干扰效果较好的重组质粒为实验的干扰靶点进行下游研究。
　　 4 RNAi重组质粒沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞的hCR基因
　　 用RNAi重组质粒和对照(pGPU6-shNC,pGPU6-shhGAPDH质粒,脂质体)转染瘢痕疙瘩成纤维细胞,同时设立对照。绘制生长曲线、Western blot法测定CDC2L1基因的蛋白变化,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。
　　 研究结果：
　　 1通过q-PCR检测证明
　　 CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中mRNA的表达水平明显升高,是人正常皮肤成纤维细胞中mRNA表达水平的38.85倍。
　　 2经酶切和测序鉴定证明
　　 CDC2L1.shRNA模板成功插入到pGPU6表达质粒中,成功构建了3个shRNA表达质粒。
　　 3通过q-PCR鉴定证明
　　 CDC2L1-1636干扰效率为67.33%,siRNA能够有效降低CDC2L1 mRNA水平,CDC2L1-1813和CDC2L1-1962抑制效率非常低,几乎没有抑制效率,从而选择CDC2L1-1636为试验的干扰靶点进行研究。
　　 4 MTT结果显示
　　 GPU6-CDC2L1-shRNA-1636质粒组较脂质体组,pGPU6-shNC对照组和未转染的空白细胞组生长速度有明显差异,差异有统计学意(p＜0.05)。Western blot法测定CDC2L1基因的蛋白变化,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,与pGPU6-shNC质粒对照组、pGPU6-shhGAPDH质粒对照组、脂质体对照组和空白对照组相比,pGPIJ6-CDC2L1-shRNA-1636质粒组CDC2L1蛋白表达水平相应下降较明显,细胞凋亡数目增加有明显的差异,差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　 结论：
　　 以上实验结果表明,CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中mRNA的表达水平明显升高,是人正常皮肤成纤维细胞中mRNA表达水平的38.85倍。hCR-siRNA可以高效、特异地抑制hCDC2L1基因表达,抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞CDC2L1基因的活性,体外研究显示CDC2L1基因具有促进瘢痕疙瘩成纤维细胞生长作用。hCR-siRNA重组质粒在瘢痕疙瘩基因治疗方面具有潜在的应用价值。迄今为止,应用体外连接方法构建RNAi重组质粒载体沉默瘢痕疙瘩成纤维细胞的hCR基因尚未见类似报道。