神经元限制性沉默因子参与大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞体外分化过程的实验研究

摘要

[目的]：
　　 1、研究成纤维生长因子bFGF，碱性生长因子EGF联合全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞体外分化过程中的神经特异性标志的表达变化。
　　 2、分析神经元限制性沉默因子(NRSF/REST)以及NRSF调控的基因在成纤维生长因子bFGF，碱性生长因子EGF联合全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元分化过程中表达的变化。
　　 3、探讨神经元限制性沉默因子(NRSF/REST)在大鼠MSCs向神经元分化的作用及MSCs向神经元分化的进程。
　　 [方法]
　　 1.通过贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，并经形态学、细胞表面标记和分化潜能鉴定。
　　 2.取P5代细胞种植于6孔板。用10ng/ml bFGF预诱导24小时后，采用成纤维生长因子bFGF，碱性生长因子EGF联合全反式维甲酸的方案进行诱导，分别于干预前与干预后1，3，5，7，9天，采用免疫细胞荧光化学检测神经元特异性稀醇化酶NSE，神经微管蛋白β-tubulinⅢ及胶质细胞标志GFAP的阳性率及实时定量PCR染料法NSE、β-tubulinⅢ和GFAP的mRNA的表达水平。
　　 3.采用实时定量PCR染料法，对照组不加诱导剂，分别于干预前与干预后1，3，5，7，9天检测神经元限制性沉默因子(NSRF/REST)及其相关基因β-TrCP、SCG10、BDNF的mRNA的相对表达量。
　　 [结果]
　　 1.通过贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，5代后细胞呈均一梭形漩涡样生长，流式细胞术检测间充质干细胞表面抗原CD34-，CD45-，CD90+。具有向脂肪细胞，神经细胞分化的多向潜能。
　　 2.应用成纤维生长因子bFGF，碱性生长因子EGF联合全反式维甲酸的诱导方案可以将MSCs诱导分化成神经元样细胞，诱导后的细胞神经元标记物神经元特异性烯醇化酶NSE，神经微管蛋白β-tubulinⅢ及胶质细胞标志GFAP呈阳性。神经元特异性稀醇化酶NSE.，神经微管蛋白β-tubulinⅢ的表达与时间呈趁势正相关，第7天表达最高，诱导第9天表达下降；胶质细胞标志GFAP于诱导第9天表达明显增加。
　　 3.神经元限制性沉默因子(NSRF/REST)于诱导第5天表达显著下降，β-TrCP于诱导第5天表达增高，NRSF的靶基因SCG10、BDNF表达有不同程度的上调。
　　 [结论]
　　 1.贴壁法可以大量培养骨髓间充质干细胞。
　　 2.采用细胞因子bFGF、EGF联合RA的诱导方案可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化。短时间内延长诱导时间可增加神经元特异性标志NSE及β-tubulinⅢ的表达，进一步延长诱导时间可诱导向胶质细胞分化。
　　 3.随着MSCs分化为神经元NRSF的表达显著下调，NRSF抑制的相关基因的表达呈不同程度的上调，表明NRSF表达下调促进MSCs向神经元分化，NRSF很可能是MSCs向神经方向分化的关键基因。