纳米及生物放大技术用于构建高灵敏电化学免疫分析方法的研究

摘要

免疫分析是建立在特异性免疫反应基础之上，结合现代分析技术对待测物分析的方法。电化学免疫传感器是将免疫识别与高灵敏的传感技术相结合而发展起来的一类新型生物分析方法。与传统的免疫分析相比，电化学免疫传感器集免疫反应、信号产生、信号检测为一体，具有能微型化、操作简单、结构紧凑、灵敏度高、成本低等特点。近年来，基于新型纳米技术、蛋白质固定化技术和信号增强技术的用于免疫蛋白检测的电化学免疫传感器的研究颇受关注。然而，在临床检测中，通常对单个样品的检测成本较高，且批量的检测会耽误病人的诊断时间，尤其对于一些急、恶性疾病，早期快速准确的检测更是十分重要。因此，具有较高的灵敏度和短的响应时间的电流型免疫传感器逐渐成为人们关注的课题，尤其是针对痕量标志物定量测定。本论文设计运用复合纳米材料作为生物分子固定化基质，同时将酶催化放大、纳米技术放大、现代生物放大技术等策略与电化学传感技术相结合，提出几种新型检测体系用于免疫蛋白分子的高效准确的检测，为其走向临床奠定基础。本论文的主要内容是：
　　 1.基于Nafion/碳纳米管/硫堇多层膜的甲胎蛋白免疫传感器的研究
　　 本研究提出将多壁碳纳米管掺杂的Nafion膜首先固载在经预处理的玻碳电极表面，利用Nafion的离子交换作用吸附带正电荷的硫堇分子，同时在电极表面形成了富含-NH2的功能膜，进一步将金纳米颗粒通过其与膜表面功能键(-NH2)的共价作用固定在电极上，随后甲胎蛋白抗体就能通过蛋白质分子上氨基或巯基与金形成Au-S键或Au-N键而将甲胎蛋白抗体共价吸附在电极表面，制得甲胎蛋白电化学免疫传感器。其特点在于：该免疫传感器利用多壁碳纳米管比表面积大从而有效增大电极的表面积的特点，将其掺杂于Nafion膜中用于传感器的构建，由于多壁碳纳米管的掺杂，可相继提高电活性物质(硫堇)和甲胎蛋白抗体的固载量；另一方面，利用碳纳米管的导电性能强，将其掺杂于Nafion膜中可提高膜的导电性，提高电活性物质与电极之间的电子传递速率，提高该免疫传感器的检测灵敏度：另外，将电活性物质固载到电极表面可有效防止其对待测物的污染和对检测的干扰。实验结果表明，该免疫传感器制作方法简单，固定化抗体分子活性保持良好且固载量大，灵敏度较高，可用于甲胎蛋白的分析测定。
　　 2.自组装夹心式功能化碳纳米管复合材料构建免疫传感器的研究
　　 在玻碳电极表面自组装一种夹心式的功能化碳纳米管复合膜，即首先在玻碳电极表面滴涂一层Nation功能化的多壁碳纳米管，通过离子交换作用吸附硫堇分子后，利用硫堇分子与金纳米颗粒之间的共价键合作用组装一层金纳米颗粒功能化的多壁碳纳米管，形成一条“金-碳纳米管-硫堇-碳纳米管-电极”的高效电子传输通道。并以此为甲胎蛋白抗体的固定化基质，制得电流型甲胎蛋白免疫传感器。其特点在于：利用多壁纳米碳管大的比表面积，提高电活性物质硫堇的固载量，增大响应信号，提高灵敏度；以双功能团分子为夹心层，金纳米粒子功能化的多壁纳米碳管为表层的纳米碳管复合纳米材料，双重增大电极比表面积，提高抗体的固载量的同时可进一步提高电子传递速率。实验结果表明，用此夹心式自组装膜来固载抗体蛋白分子制得的电流型免疫传感器具有更高的灵敏度和良好的选择性。
　　 3.Oil-water界面固载生物酶的催化微球用于标记夹心式免疫传感器的研究
　　 本研究将生物相容性好的胶原蛋白与半导体纳米材料TiO2制得复合物后，用于捕获抗体的固载，可有效保持其生物活性的同时提高抗体的固载量。随后采用恒电位溶出法在其表面沉积一层金纳米膜，进一步增大电极的表面积，提高捕获抗体的固载量。此外，本研究将金纳米颗粒、辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白抗体(HAFP)、辣根过氧化物酶(HRP)以一定比例先后混合，通过金纳米颗粒与蛋白质分子上的氨基或巯基共价结合形成生物耦合物，由于HRP为小分子蛋白，在制备过程中过量的加入HRP可封闭非特异性吸附位点的同时增大酶分子的固载量。加入有机相后，合成的生物耦合物可通过界面的表面张力固定在其表面形成催化微球。此方法制备的催化微球表面固载了大量的HRP和检测抗体(HAFP)，并将其用于标记制备双抗夹心式免疫传感器来检测甲胎蛋白，可通过酶对底物的催化作用来实现检测信号的放大，提高检测的灵敏度。本实验对制备催化微球及其标记的免疫传感器做了表征，并对免疫传感器的响应性能进行研究。结果表明该信号增强型的电流型免疫传感器具有制备方法简单、检测限低，选择性等特点。
　　 4.球形二茂铁功能化石墨烯复合纳米材料标记的电化学免疫传感器用于猪链球菌2型抗原的检测
　　 采用超声溶剂置换的方法成功制备出具有电活性的球形羧基二茂铁，然后通过活化交联试剂(EDC/NHS)将其功能化于还原石墨烯上，制得电活性球形二茂铁功能化的石墨烯，并用于标记猪链球菌2型多克隆抗体(检测抗体)。利用石墨烯的致密结构与大的比表面积，可大量固载具球形二茂铁，继而提高检测抗体的固载量及其与识别抗原的结合效率。本研究基于该纳米复合材料成功制得一种夹心式电化学免疫传感器来检测猪链球菌2型抗原。通过抗坏血酸在底液中被球形羧基二茂铁催化氧化来进一步增强电化学响应信号，提高检测的灵敏度。
　　 5.铂纳米粒子负载羧基二茂铁与辣根过氧化物酶结合物标记的滚环复制产物用于标记信号增强型电化学免疫传感器的研究
　　 该夹心式免疫传感器是采用小分子单链DNA(pDNA)通过纳米材料标记检测抗体，通过扣锁探针与之杂交后，在Phi29DNA聚合酶和T4DNA连接酶作用下实现原位扩增，其产物是一条含有多个相同片段的长单链DNA。同时将羧基二茂铁(Fc)与辣根过氧化物酶(HRP)在活化交联试剂的作用下混合制得羧基二茂铁与辣根过氧化物酶的生物结合物(Fc-HRP)，随后将其固载在铂纳米粒子上，用于标记检测单链DNA(dDNA)。通过其与滚环复制的产物的特异性结合，产生多重放大电化学信号，实现对蛋白质高特异性、高灵敏的检测。具有以下特点：该免疫传感器将滚环复制技术、酶催化放大、纳米放大技术联用于多重信号增强型免疫传感器；通过比表面积大的金纳米颗粒固载pDNA，比传统的共价键合作用的固载量大；通过滚环复制技术将pDNA原位延长，其产物拥有多个相同片段，实现信号的第二重放大；使用负载大量Fc-HRP的铂纳米粒子标记检测DNA，使电活性物质大量的固载，实现信号的第三重放大；通过酶对底物的催化作用以及铂纳米粒子的协同催化作用实现信号的第四重放大。实验结果表明，由此策略构建的免疫分析方法具有更高灵敏度及更好的选择性。