应用siRNA技术沉默TWIST基因表达对鼻咽癌细胞株CNE-2致瘤性的影响

摘要

[目的]
　　 Twist属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白家族，是一个保守的转录因子，在不同的种属中其DNA结合区域序列高度保守，都能结合一种E-box的DNA序列：CANNTG。新近研究表明Twist具有癌基因的特性，多项研究结果证实，Twist过表达在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。Twist在多种人类恶性肿瘤中都有高表达，同时也参与了某些上皮源性的肿瘤细胞的EMT过程，促进其侵袭转移。本研究通过构建Twist shRNA真核表达载体，特异性沉默Twist基因表达，探讨其对人鼻咽癌细胞株CNE-2的迁移、侵袭和增殖等生物学活性的影响。
　　 [方法]
　　 在Genbank中查找出Twist基因的cDNA序列(NM_000474)，根据Ambion公司提供的siRNA Target Finder设计软件，按照RNAi的设计原则，设计出3个针对Twist的siRNA序列，分别命名为Twist-siRNA-1、2、3，同时根据Twist-siRNA-1另行设计一个随机序列阴性对照，命名为Twist-siRNA-scramble。将以上siRNA序列由上海生工合成，通过T4连接酶将siRNA序列分别插入到瞬时表达的pGenesil-1质粒中，构建四种重组质粒，分别命名为：pGenesil-1-Twist-shRNA-1、2、3和pGenesil-1-Twist-shRNA-scramble，DNA测序检测重组质粒是否构建成功。用脂质体法将重组质粒分别转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2中，48h后以RT-PCR法检测各组Twist mRNA表达量的变化，72h后以Western blot法检测各组Twist蛋白表达量的变化，从而筛选出沉默效果最好的siRNA序列。将含有沉默效果最好的siRNA序列的重组质粒转染CNE-2细胞，以空载质粒组和空白对照组作为对照，MTT法检测细胞的增殖抑制情况，细胞创伤愈合试验观察细胞迁移能力的变化，Transwell小室试验检测细胞侵袭能力的变化。
　　 [结果]
　　 测序结果显示，Twist-siRNA序列成功插入到pGenesil-1表达质粒中。RT-PCR和Western blot结果显示，转染pGenesil-1-Twist-shRNA-2质粒组的干扰效果最明显。转染pGenesil-1-Twist-shRNA-2质粒组细胞生长速度减慢，与对照组相比差异有统计学意义(*p<0.05)。细胞创伤愈合试验显示转染pGenesil-1-Twist-shRNA-2质粒组细胞在24h、48h、72h进入划痕区域的细胞数少，表明Twist与鼻咽癌细胞株CNE-2的迁移成正相关。Transwell小室试验表明，转染pGenesil-1-Twist-shRNA-2质粒组48h后穿过膜的细胞数目明显减少，与对照组相比差异有统计学意义(*p<0.05)，表明Twist下调可以显著降低鼻咽癌细胞株CNE-2的体外侵袭能力。
　　 [结论]
　　 针对Twist的特异性siRNA能够有效抑制CNE-2细胞中Twist基因的表达。Twist基因被沉默后，对CNE-2细胞的增殖有抑制作用，同时使得其迁移和侵袭能力明显降低，提示Twist可能作为鼻咽癌防治的一个新的靶点。