可溶性环氧化物水解酶抑制剂的筛选的及抗炎作用的研究

摘要

[目的]
　　 可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)是花生四烯酸代谢的关键酶之一，参与机体内炎症、癌变和心血管系统病变等多种病理过程。抑制sEH，可以起到抗炎、抗动脉粥样硬化、降血压和抗癌的作用，因此sEH成为了抗炎、抗动脉粥样硬化等药物开发的新靶点。目前已开发的sEH抑制剂均为化学合成，代谢快，毒性高，成本高，应用价值较低。本课题以sEH为靶点，从天然药物成分中筛选低毒高效的sEH抑制剂，探讨其抑制机理，并观察其抗炎作用，为开发新的天然类抑制剂打下基础。
　　 [方法]
　　 1.选择三种细胞：小鼠巨噬细胞株RAW264.7、人脐静脉内皮细胞HUVEC和人肝癌细胞株Huh7，建立最佳培养条件，比较三种细胞内酶活性，选择适合的细胞建立sEH抑制剂筛选模型；
　　 2.选择一系列具有抗癌、抗炎、降血压、降血脂等中药或单体等作为待选药物，MTT法检测细胞毒性确定低毒性药物浓度；
　　 3.每种药物选择两个低毒性浓度，使用商品化的试剂盒测定药物处理后细胞内sEH酶活性，与溶剂对照组比较，确定药物对酶活性影响；
　　 4.针对筛选出的药物，设计浓度梯度进行进一步的酶活性抑制检测，检测酶活性抑制是否具有剂量依赖性，并确定最佳浓度；
　　 5.使用每种药物的最佳浓度，检测药物对直接酶活性的抑制作用，RT-PCR和Western bloting检测药物对sEH mRNA和蛋白水平的影响。
　　 6.脂多糖LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型，检测筛选药物对炎症模型的影响：Griess法检测一氧化氮的变化，DCFH-DA荧光探针检测活性氧的变化，ELISA法检测白介素-1和肿瘤坏死因子α的变化，EIA法检测筛选药物对花生四烯酸COX-2通路关键酶COX-2活性的影响，RT-PCR和Western bloting检测药物对COX-2基因表达。
　　 [结果]
　　 经比较，肝癌细胞Huh7可作为sEH抑制剂筛选模型，通过可溶性环氧化物水解酶抑制剂筛选模型，筛选出原花青素、青藤碱、槲皮素、黄芩素、木犀草素5种药物剂量依赖性抑制sEH酶活性；探讨药物对酶活性抑制机理，这些药物对sEH直接酶活性无明显抑制作用，而对sEH mRNA和酶蛋白表达均有明显抑制作用。原花青素和木犀草素能有效降低炎症模型中一氧化氮、活性氧、白介素-1β和肿瘤坏死因子α等一系列炎症因子的水平，下调COX-2活性和基因表达。
　　 [结论]
　　 成功建立sEH抑制剂筛选模型，筛选出原花青素、青藤碱、槲皮素、黄芩素、木犀草素对酶活性有较强抑制作用，这些药物均对直接酶活性无抑制作用，均下调sEH基因表达；原花青素和木犀草素还对COX-2活性和基因表达有明显抑制作用，降低炎症因子水平，对双通道具有抑制作用。