山东省番茄黄化曲叶病毒的遗传多样性及种群结构

摘要

番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)隶属双生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus),由烟粉虱(Bemisiatabaci)传播。该病毒引起的番茄黄化曲叶病(Tomatoyellowleafcurldisease,TYLCD)几乎遍及所有热带和亚热带地区,危害严重,已成为世界番茄产业的主要限制性因素之一。TYLCV于2006年在我国首次报道后急速蔓延,随后在多个省市大面积爆发,2008年在山东聊城、寿光、临淄等多个地市发现TYLCV的严重危害,受灾面积达95%,减产55%左右。为了弄清侵染山东番茄的双生病毒种类,为进一步开展该病毒病害的防控研究提供理论依据,我们在山东枣庄、菏泽、临沂、泰安、济南、淄博、潍坊、德州和滨州等9个区市的番茄主产区采集了140个疑似TYLCV侵染的番茄样本,对其进行了病原分子鉴定和变异分析。
　　 利用双生病毒简并引物PA/PB在107个样品中PCR扩增得到约500bp的特异片段,在枣庄、菏泽、临沂、泰安、济南、淄博、潍坊、德州和滨州等地区番茄上双生病毒的检出率分别为91.7%,54.5%,66.7%,62.5%,75.0%,71.4%,85.0%,100%和80.0%。随机选取2个阳性样品对该片段进行克隆测序,经序列比较发现这2个片段之间的相似性为98.5%,与已报道的TYLCV各分离物相应片段的相似性都在94%以上。随机选取其中4个不同区市分离物SD11、SD28、SD39和SD65,对其DNA-A全基因组进行了克隆和序列分析,结果表明,4个DNA-A全长分子均为2781nts,具有典型的Begomovirus属病毒的基因组结构特征,且与我国上海、安徽等地报道的TYLCV分离物相似性均在98.5%以上,表明它们是TYLCV的分离物。设计TYLCV特异性引物TYT-F/TYT-R对140个样品进行PCR扩增,从107个样品中均扩增到430bp大小的目的条带,检出率及检出的样品编号与PA/PB检测结果相吻合。PCR检测表明,所有样品中均未扩增到DNA-B组份,且未伴随卫星DNA分子。
　　 序列比较发现,尽管TYLCV在世界范围内广泛发生,但大多数分离物核苷酸序列相似性在93%以上,相较Begomovirus属病毒其变异程度小。为了弄清楚其核苷酸序列保守的原因,为分析TYLCV的遗传进化轨迹及番茄抗TYLCV分子育种提供科学依据,本研究以山东和陕西自然感染TYLCV的田间番茄为材料,从分子克隆出发,对TYLCVDNA-A的种群结构、变异水平及碱基突变类型进行了研究和分析。
　　 对TYLCV种群结构的分析结果表明,TYLCV符合病毒准种结构的特性,即是由主序列和一系列十分相近但不完全一致的序列变异体共同组成的病毒群体。其种群突变克隆百分率及突变频率均较低,分别为21.0%和2.36×10-4,其中2008年11月获得的山东寿光分离物SD1DNA-A种群的变异水平与2011年11月获得的陕西泾阳分离物SX15相当,而2011年7月获得的山东寿光分离物SD98DNA-A种群的突变频率则较低,为5.42×10-5,即同种地区不同时间及不同地区相同时间获得TYLCV种群变异水平无明显规律。
　　 对TYLCV种群内碱基突变的分析表明,碱基突变在IR-AC1区内均有分布,但主要集中在IR5'区及AC1非重叠区。种群内碱基突变类型主要是碱基的替代突变,且C-T之间的碱基颠换为种群的主要碱基突变类型。陕西分离物SX15种群出现了突变积累的现象,实验中在AC1非重叠区的2152位以及在IR5'区的37位和59位多次被检测到相同类型的突变,是否这些位点突变的变异体具有选择优势还需进一步生物学验证。对TYLCV在AC1-AC4区发生的碱基突变及由此引起的氨基酸突变分析结果表明,AC1区上的碱基突变,无论是在重叠区还是在非重叠区,均为非同义突变,而AC4区,突变均为同义突变。
　　 对采自不同时间及地区的TYLCV种群序列分析表明,各分离物的主序列差异较大,其中SD1种群的主序列在SX15种群中以突变体的形式出现,由此推测,在选择压力下TYLCV的一些优势序列在时空进化过程中渐渐被取代甚至淘汰。