尿激酶介导的肿瘤靶向性rhTNF-a融合蛋白纯化及生物活性研究

摘要

[目的]
　　 肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是由激活的巨噬细胞产生的一种多功能细胞因子，其最显著的特征是在体内外直接杀伤肿瘤细胞，是一种具有潜在应用价值的抗肿瘤生物制剂。随着分子生物学技术的飞速发展，应用基因工程手段制备高效低毒的hTNF-α突变体和具肿瘤靶向性的TNF-α融合蛋白呈现出较好的应用前景。本实验在前期实验的基础上，通过GST·Bind树脂纯化融合蛋白，确定纯化条件并测定其比活性，研究其对肿瘤细胞的杀伤作用，初步研究其诱导肿瘤细胞凋亡情况，为进一步研究打下基础。
　　 [方法]
　　 利用GST·Bind Resin纯化四种融合蛋白，BCA法测定其浓度，SDS-PAGE鉴定其纯度；以L929细胞株为靶细胞，MTT法测定融合蛋白细胞毒性和比活性以及测定融合蛋白对CNE2-Z、A549和H446三种肿瘤细胞的杀伤作用；Hoechst33258染色后荧光显微镜观察融合蛋白对肿瘤细胞形态的影响。
　　 [结果]
　　 1.采用GST·Bind Resin一步法纯化四种融合蛋白，并在柱上用凝血因子(Factor Xa)切除其上的GST标签，获得纯度95％以上的目的蛋白。确定了融合蛋白的纯化方案，并柱上用uPA酶切验证uPA对融合蛋白的去封闭效果并获得纯度为93％的去封闭后融合蛋白。
　　 2.以L929细胞株为靶细胞，做融合蛋白及其去封闭后产物的受体亲和实验，结果显示：融合蛋白各组相对于标准品毒性都有较大幅度降低，降幅依次为38.2％、34.5％、21.7％和38.8％。提示N端foldon和uPA底物序列对hTNF-α突变体N端受体结合部位有一定封闭作用；uPA酶切后去封闭融合蛋白各组亲和实验显示除uPA酶切后融合蛋白U3活性升高8.78％外，其他各组均有较小幅度下降，降幅依次为16.7％、11.24％和6.21％。可知经uPA酶切后融合蛋白U2、U3和U4基本保持了TNF-α原型的活性，说明改造并未对其活性造成较大的影响。
　　 3.MTT法测定hTNF-α标准品、融合蛋白U1、uPA酶切后U1、融合蛋白U2、uPA酶切后U2、融合蛋白U3、uPA酶切后U3、融合蛋白U4和uPA酶切后U4的比活性依次为9.9×107U/mg、6.13×107U/mg、8.47×107U/mg、6.71×107U/mg、8.77×107U/mg、7.35×107U/mg、10×107U/mg、7.14×107U/mg和7.75×107U/mg。
　　 4.测定融合蛋白对三种癌细胞(CNE2-Z、A549和H446)的LD50，hTNF-α标准品、融合蛋白U1、融合蛋白U2、融合蛋白U3和融合蛋白U4对CNE2-Z细胞LD50依次为：0.446 ug/ml、0.521 ug/ml、0.505 ug/ml、0.442 ug/ml和0.478 ug/ml；对A549细胞LD50依次为0.27 ug/ml、0.315 ug/ml、0.291 ug/ml、0.274 ug/ml和0.296 ug/ml；对H446细胞LD50依次为0.234 ug/ml、0.257 ug/ml、0.253 ug/ml、0.238 ug/ml和0.249 ug/ml。各组除融合蛋白U3与标准品LD50相近(p>0.05)以外，其他各组LD50均高于标准品LD50。
　　 5.四种融合蛋白均可诱导细胞发生凋亡，荧光显微镜下观察其形态，可看到较明显的凋亡形态学变化，胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩。
　　 [结论]
　　 纯化四种融合蛋白，确定了纯化条件；四种融合蛋白及其酶切产物均保持了原有的生物学活性，进一步验证了uPA底物序列的封闭效果，四种融合蛋白均能能诱导高表达uPA的肿瘤细胞凋亡。