DR6重组表达载体的构建及NAPP在毕赤酵母中的表达、纯化及其对神经细胞凋亡的初步研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种患病率高的神经系统疾病,以严重的高级认知功能和记忆功能障碍为临床特征。死亡受体-6(death receptor-6,DR6)是肿瘤坏死因子超家族中的成员,它是Ⅰ型跨膜受体,全长655个氨基酸,理论分子量约为35KDa,在很多肿瘤细胞系中高表达。DR6在N末端有一段公认的信号肽序列(1-41氨基酸),四个胞外半胱氨酸区域(42-211氨基酸),在它的胞浆段,包含有一个死亡结构域(428-494氨基酸)。淀粉样前体蛋白(amyloid precursorprotein,APP)是一种Ⅰ型跨膜蛋白,由巨大的胞外氨基端区,疏水的跨膜区及小段的胞内羧基端区构成。研究表明APP在细胞生长、细胞粘附、突起生长、突触发生、创伤修复等多方面有多种功能。然而,APP精确的生物学功能及其已知衍生物的功能至今仍然不是十分清楚。近来研究发现,APP是DR6的配体,在神经营养因子被剥夺的条件下,触发胞外APP的N端部分片段被β-分泌酶切割脱落产生N-APP(amino-terminal fragment of APP),与表达于神经元轴突上的DR6结合,以依赖于caspase-3和caspase-6的信号通路引起神经元轴突的变性、崩解,并最终导致神经元的凋亡,引发阿尔茨海默病。神经元和轴突的退化是阿尔茨海默氏症的生物标志。因此,研究DR6、NAPP的功能、结构及其对神经细胞的凋亡作用与机制成为探索阿尔茨海默病病因、病理、定位AD治疗药物靶标、开发新的AD治疗药物的有效途径之一。
　　 本研究以含有DR6全长cDNA的质粒为模板,采用PCR方法扩增DR6(aa42-218/aa42-349)的DNA片段,连接至毕赤酵母表达载体pPIC9K,成功构建重组质粒pPIC9K-DR6(aa42-218/aa42-349),测序验证后将其电击转化至毕赤酵母菌株GS115,得到分别表达DR6不同氨基酸片段的两个酵母重组子菌株。同时将实验室保存重组质粒pPIC9K-NAPP(aa18-185)电击转化毕赤酵母菌株GS115,经过组氨酸营养缺陷平板筛选及抗G418筛选,得到高拷贝酵母重组转化子。经菌落PCR验证,目的基因NAPP(aa18-185)转入酵母菌中。鉴定酵母转化子的甲醇利用型为Mut+后,经甲醇诱导实现了高效分泌表达,SDS-PAGE电泳显示,表达上清中有分子量大小约为34 kD的外源蛋白产生,纯化后Western blot证明其为目的蛋白。
　　 为了研究DR6和NAPP在神经细胞中的作用,利用配体对受体作用,还纯化得到DR6的配体NAPP,用NAPP去刺激神经母细胞瘤细胞SHEP-1,看对其生长凋亡的影响。实验利用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度的NAPP处理培养的SHEP-1细胞的凋亡率。流式细胞检测结果显示NAPP组凋亡指数分别为:处理12h各处理浓度(分别为0,2.5,5,10,20,40μg/ml)细胞凋亡率为(1.91±0.5)%(1.92±0.6)%(2.61±0.5)%(3.21±0.7)%(3.81±0.8)%.;处理24h各处理浓度细胞凋亡率为(4.92±0.4)%(5.66±0.5)%(6.81.±0.6)%(7.57±0.4)%(7.29±0.8)%;处理48h各处理浓度细胞凋亡率为(5.46±0.4)%(6.38±0.1)%(8.08±0.4)%(9.51±0.5)%(8.91±0.6)%,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。Annexin V-FITC/PI法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞;NAPP能够诱导SHEP-1细胞过度凋亡,且凋亡率随着NAPP浓度的增加和时间的延长而增加。本实验初步证明了重组的NAPP对SHEP-1神经母细胞瘤细胞有明显的诱导凋亡作用,为下一步研究APP和DR6的生物学功能及结构奠定基础,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础。