桑枝中桑皮苷A的分离纯化工艺及其活性研究

摘要

桑枝是中国传统的中药材之一,历代药典均记载其具有多种药用功效。我国是蚕桑业大国,每年由于夏伐和冬季重剪产生的桑枝条上千万吨,远远大于其作为中药材的需求量,多余的部分被当做柴火烧掉,造成极大的资源浪费和严重的环境污染。现代植物学研究表明:桑枝皮中含有丰富的桑皮苷A,具有抗炎、镇痛、止咳、抗肿瘤、抗病毒、保护大脑等多种生物活性,具有广阔的应用前景,但目前的研究还缺乏系统性。因此,本实验以桑枝皮为原料,从提取、分离以及抗氧化性等多个方面对桑皮苷A进行了研究,同时对其转化和诱导进行了探讨。主要的研究内容和实验结果如下:
　　 1、桑皮苷A的生产工艺研究
　　 本实验建立了桑皮苷A的定性定量检测方法,即薄层层析法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。薄层层析法的条件为硅胶层析板(GF254),展开剂为V氧气V95%乙醇=2:1的混合溶液。HPLC的色谱条件为SpherisobC18色谱柱(150mm*4.6mm,5μm)、流动相为V甲醇V水=20:80、流速1mL/min、进样体积10.0μl和检测波长330nm。
　　 采用响应曲面法(RSM)对桑皮苷A的提取工艺进行了优化,在单因素试验的基础上,选择提取温度、提取时间、液料比为随机因素,进行3因素3水平的Box-Behnken中心组合设计,分析3个因素对响应值的影响。其最佳提取工艺为:提取溶剂为自来水、提取温度29℃、提取时间120min、液料比23mL/g。通过静态吸附和动态吸附实验,探讨了D101和聚酰胺树脂分离桑皮苷A的最佳实验参数。D101树脂静态吸附最佳条件为:吸附1h、上样量为1.2106mg/mL、洗脱剂为40%乙醇:动态吸附最佳条件为:流速18BV/h、上样量为2.9141mg/m、洗脱剂为40%乙醇。聚酰胺树脂静态吸附最佳条件为:吸附1h、上样量为0.9617mg/mL、洗脱剂为40%乙醇;动态吸附最佳条件为:流速18BV/h、上样量为2.4284mg/mL、洗脱剂40%乙醇。在研究了D101树脂和聚酰胺树脂分离纯化桑皮苷A的特性的基础上,确定了D101树脂粗分,聚酰胺细分,D101和聚酰胺相结合的分离方式,使用该方法可一次性将桑皮苷A的纯度提高到76.9%。
　　 2、重庆地区主要种植的桑树品种桑枝皮中桑皮苷A含量差异的比较
　　 利用上述实验建立的检测方法和提取条件,对重庆地区主要种植的桑树品种桑枝皮中桑皮苷A的含量进行了测定。结果显示:不同品种之间桑皮苷A的含量差异较大,嘉陵20号(4.64%)>嘉陵16号(2.73%)>湖桑32号(2.63%)>云桑1号(2.54%)>西庆1号(2.36%)>西庆4号(1.90%)>育2号(0.79%)>7920(0.69%)>桂优62号(0.39%)>西农6071(0.18%),这为进一步开发利用桑枝中桑皮苷A提供了一些基础数据。3桑皮苷A的抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的测定
　　 本实验以维生素C、维生素E和熊果苷为对照,通过测定桑皮苷A及其衍生物白藜芦醇和氧化白藜芦醇对DPPH、ABTS+的清除能力和还原能力,从清除自由基和还原力两方面比较了三者之间的差异。结果显示:清除DPPH自由基的活性,维生素C>维生素E>氧化白藜芦醇>白藜芦醇>桑皮苷A>熊果苷;清除ABTS自由基的活性,白藜芦醇>氧化白藜芦醇>熊果苷>桑皮苷A>维生素C>维生素E;总还原力的活性,维生素C>白藜芦醇>氧化白藜芦醇>维生素E>熊果苷>桑皮苷A。以熊果苷为对照,比较了桑皮苷A和氧化白藜芦醇的抑制酪氨酸酶活性。结果表明:桑皮苷A和氧化白藜芦醇对酪氨酸酶具有明显的抑制活性,桑皮苷A的抑制活性较好,是熊果苷的3.3倍,但略低于氧化白藜芦醇。4桑皮苷A的酶解转化初步研究
　　 通过单因素试验,首先探讨了酶解法水解桑皮苷A为氧化白藜芦醇的可能性,然后从酶解时间和酶—底物质量比两个方面研究了水解反应的最佳条件。结果显示:最佳的酶解时间为20min,最佳的酶—底物质量百分比为4%。