bock1在斑马鱼胚胎头部后脑血管发育中的功能研究

摘要

bock1是一个新型的膜结合天冬氨酸蛋白酶，是由501个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白。研究发现，bock1基因能调节髓鞘形成，其在正常神经系统的发育中也起着关键作用。但是关于bock1斑马鱼体内的性质和功能方面的研究开展得仍然相当有限，其与人类和老鼠中表达部位不一致，而导致暂时无法预测其可能存在的底物和参与的代谢途径。
　　血管生长是一个复杂的过程，它是在原有血管的基础上出芽、迁移形成新的血管。因此这个过程与许多血管相关的疾病有密切关系，此外血管生成对胚胎的发育也起着至关重要的作用。其中头部血管系统的发育至关重要，其对于中枢神经系统的生存和发育都是必须的，对于脑中风及其他的大脑疾病影响也非常巨大。头部血管的形成是可再生的，它的形成模式遵循一定的规律。斑马鱼的心血管系统在基因水平上85％与人类同源，早期发育与人类也极为相似。因此利用斑马鱼研究血管发育过程，及参与其中的重要因子的作用，可以为临床医学提供很好的理论基础。
　　近年来，血管形成发育及再生的分子机制研究取得了许多突破性进展。在生物体中，神经与血管一般都相伴相生，二者形成相似的网络结构，而研究也表明，血管网络与神经网络的形成有许多共同的分子机制参与其中，二者相互调控。而在鸡和斑马鱼的研究中将更多的分子信号途径与血管网络形成及神经网络形成偶联起来。
　　在本课题研究中，我们首先克隆出斑马鱼的bock1基因，通过全胚胎原位杂交对其在斑马鱼胚胎发育的不同时期的表达模式进行了研究，发现bock1在斑马鱼体内主要表达在头部。然后利用斑马鱼转基因系Tg(flk1:GFP×gata1:DsRed)，绿色荧光蛋白(GFP)标记血管内皮细胞，红色荧光蛋白(DsRed)标记血细胞，利用显微注射技术，在1-2个细胞时期注射特异性的吗啡林（morpholinos）修饰性寡核苷酸，并通过共聚焦显微镜观察其形态学变化，实验发现敲降内源性bock1之后，头部血管丛在36hpf发生明显的缺陷，尤其是脑血管BA和CtAs的形成缺陷。这些缺陷可以通过注射bock1mRNA被部分回救。其次注射bock1mRNA于胚胎中，观察过表达bock1的表型发现，斑马鱼全身的血管形成分枝增多，形成模式有一定程度的紊乱。
　　血管网络与神经网络的形成有许多共同的分子机制参与其中，二者相互调控。bock1基因能调节髓鞘形成，组成髓鞘的施旺细胞能分泌VEGF使得动脉血管沿着神经纤维分布。而VEGF对于头部后脑血管血管的出芽也有着重要的作用。因此利用标记与VEGF信号相关的的分子探针vegfa，vegfc、flt4，dll4，和组成髓鞘的施旺细胞相关的分子探针gfap进行全胚胎原位杂交，实验发现vegfa、flt4、dll4和gfap在敲降内源性bock1基因的胚胎中表达均下调;在共注射bock1MO和vegfamRNA的胚胎中发现，vegfamRNA能部分回救敲降bock1对头部血管造成的表型。结果表明，bock1基因影响头部后脑的血管发育，且该过程可能与VEGF信号有关，主要通过施旺细胞介导，通过vegfa起作用。
　　随后，为了进一步对bock1与vegfa相互作用机制进行深入研究，我们对bock1具体表达的组织进行进一步定位。首先利用斑马鱼转基因系Tg(flk1:GFP×gata1:DsRed)，绿色荧光蛋白(GFP)标记血管内皮细胞，红色荧光蛋白(DsRed)标记血细胞。收集其30hpf的斑马鱼胚胎的头部，通过流式细胞仪分选出头部的绿色荧光细胞和红色荧光细胞，检测bock1在血管或者血液中是否有表达。但在随后的RT-PCR实验中，并不能扩增出bock1特异性的条带，证明bock1并不在血管和血液中表达。而bock1具体表达的特异性组织，还有待进一步实验的检测证明。本实验为更早的预防和治疗中风，脑出血等脑血管疾病提供了一定的理论基础，同时也对神经血管相互调控机制的研究具有一定的指导意义。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

前言

1．1 斑马鱼胚胎发育时期血管的形成过程

1．2 斑马鱼胚胎发育时期头部后脑血管的形成过程

1．3 神经与血管网络发育过程中共同的分子机制

1．4 研究的选题依据

第二章 材料和方法

2．1 实验动物

2．2 试剂、耗材和仪器

2．3 培养基和有关主要试剂的配置

2．4 质粒和菌株

2．5 实验方法

2．5．1 斑马鱼总RNA的提取

2．5．2 反转录制备cDNA

2．5．3 重组质粒的构建

2．5．4 反义探针的制备

2．5．5 mRNA的制备和纯化

2．5．6 胚胎显微注射

2．5．7 全胚胎原位杂交(Whole mountin situ hybridization)

2．5．8 用FACS筛选带有不同荧光的细胞

2．5．9 RT-PCR

第三部分 实验结果

3．1 抽提的RNA浓度和反转录得到的cDNA浓度

3．2 在斑马鱼基因组中克隆bock1基因

3．3 bock1基因在斑马鱼胚胎中的表达

3．4 bock1基因对斑马鱼头部后脑血管发育的影响

3．4．1 注射bock1 MO导致斑马鱼头部后脑血管形成缺陷

3．4．2 注射boek1 mRNA能导致血管分枝增多，血管形成模式紊乱

3．4．3 bock1 mRNA能特异性的回救bock1 MO的表型

3．4．4 bock1对血管-神经网络系统特异性标记基因的影响

3．4．5 Vegfa mRNA能特异性的回救bock1 MO的表型

3．4．6 注射bock1 MO导致斑马鱼施旺细胞标记基因gfap表达下调

3．4．7 运用RT-PCR检测bock1特异性表达的组织

第四部分 讨论和分析

参考文献

致谢