家蚕雄蛾触角特异谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4的基因克隆、表达及功能研究

摘要

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferases,GSTs,EC2.5.1.18)是多功能的超家族酶类,广泛存在于动物、植物、昆虫、细菌及真菌中。其主要功能是对内源或异源性有毒物质进行代谢解毒。除此之外,其还具有抗氧化应激作用,异构酶作用,并参与哺乳动物信号通路调控。有些GSTs还有非催化作用地结合和转运不同配体功能。有一类嗅觉相关的谷胱甘肽-S-转移酶在牛、大鼠、烟草天蛾、棉铃虫以及柑橘凤蝶中被鉴定,并猜测在嗅觉中发挥作用。
　　 家蚕Delta亚家族谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTd4与烟草天蛾触角特异基因GST-msolf1序列同源性高达70%以上,而在进化树上聚为一簇。并且BmGSTd4没有全长CDS序列,报道较少。基于以上线索,猜测BmGSTd4的功能是否与嗅觉相关?
　　 主要研究结果如下:
　　 1.BmGSTd4基因的表达特征分析
　　 利用RT-PCR对BmGSTd4基因在不同发育时期和不同组织中的表达特征进行分析。结果表明BmGSTd4在家蚕从蚁蚕至化蛾第1天的不同发育时期中,只在雄蛾第1天具有微量表达。为了进一步验证时期表达谱显示的结果,在五龄第3天各组织中没有表达,取蛾期不同组织进行表达模式分析,发现BmGSTd4在雌蛾各组织中无表达,只在雄蛾第1天的触角中特异并高量表达,这一结果与时期表达谱结果一致。
　　 2.BmGSTd4基因的全长克隆及序列分析
　　 家蚕delta亚家族谷胱甘肽-S-转移酶有4个成员,从NCBIGenBank下载家蚕BmGSTd4不完整序列,对其氨基酸序列进行结构域预测。
　　 以家蚕的大造品种雄蛾触角中提取的总RNA反转录的cDNA为模板,利用RACE技术分别得到225bp大小的5'端片段和221bp大小的3'端片段,将两段序列与余预测的基因序列进行比对,去除重叠序列,拼接后得到1049bp(含polyA)大小的全长cDNA序列。通过ORF检索,该序列由738bp的编码区,90bp的5'UTR和221bp的3'UTR组成,共编码246个氨基酸,蛋白大小27kDa,等电点pI为4.66。染色体定位结果显示该基因位于家蚕6号染色体上的nscaf2853上,由一个内含子和一个外显子组成。结构域预测显示该基因编码的蛋白质具有完整的结构域,即GST的N端结构域和C端结构域。信号肽预测前22个氨基酸为信号肽。
　　 利用Clastalx将BmGSTD4与从NCBI上下载的已报道其他物种的谷胱甘肽转-S-移酶氨基酸序列进行比对,再用MEGA5软件构建进化树。结果显示,家蚕Delta家族两两聚为一簇,BmGSTD2、BmGSTD3聚类在一起,与柑橘风蝶嗅觉基因进化关系相近,BmGSTD1和BmGSTD4聚类在一起,与烟草天蛾、棉铃虫嗅觉特异基因进化关系一致。
　　 3.BmGSTD4的原核表达与抗体制备
　　 由于BmGSTd4编码蛋白质预测含有信号肽,并且为了改善原核表达情况,对BmGSTD4截短了N端前24个氨基酸残基进行表达。成功构建带有N端His标签的BmGSTd4-p28融合蛋白表达载体,并在Rosetta(DE3)表达菌株中成功诱导表达。
　　 通过Ni-NTA亲和层析纯化原核表达的重组BmGSTD4蛋白,得到的蛋白进行除盐和浓缩,得到约500μL浓度为13μg/μL的重组蛋白。取200μLBmGSTD4蛋白制备商业化多克隆抗体,抗体效价是1:100000。
　　 4.BmGSTD4的定位和功能初探
　　 利用纯化得到的BmGSTD4和制备的多克隆抗体,进一步利用westernblot在蛋白水平上验证BmGSTD4的特异性。结果显示BmGSTD4在雄蛾触角中特异表达,与RT-PCR结果相一致。
　　 在雄蛾触角中进行BmGSTD4的免疫荧光定位,与对照相比:在嗅觉感器中发现明显的荧光信号,可以证明BmGSTD4存在于嗅觉毛形感受器中。
　　 以1-氯-2,4-硝基苯(CDNB)作为反应底物,测量BmGSTD4在340nm处的吸光值变化。在通过软件分析得到标准酶活曲线,并计算出Km值是0.020±0.001(mM),Vm值是176.302±4.943(μmol/min/mg),说明BmGSTD4具有较好的活性。
　　 RT-PCR和westernblot结果证明BmGSTD4的雄蛾触角特异性,免疫荧光定位结果说明其存在于嗅觉毛形感受器中。酶学测定结果显示重组表达的BmGSTD4具有较好的GST解毒活性。这些结果暗示BmGSTD4在感器腔内的淋巴液中发挥解毒功能,对触角进行保护。BmGSTD4的触角特异是否暗示其在嗅觉中具有其它功能还需下一步验证。