BmNPV感染对家蚕幼虫中肠围食膜的影响

摘要

围食膜(Peritrophicmembrane，PM)是昆虫在长期的进化过程中由中肠细胞分泌的一非细胞的网状膜结构，并贯穿于整个中肠，主要由糖蛋白和几丁质构成，类似于脊椎动物粘液层，是病原微生物通过肠道进入昆虫体内的第一道生理屏障，保护着昆虫中肠上皮细胞免受食物磨损和病毒入侵等。研究发现昆虫的围食膜的结构被破坏后，病毒的感染速度增快和昆虫的死亡率增高。作为鳞翅目昆虫的代表，家蚕生理生化、病理学已有大量的研究报道，基因组学研究在近十年来长足发展，但在围食膜方面的研究却少见。家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus，BmNPV)感染家蚕所引起家蚕核型多角体病是蚕业生产上的主要病害之一，导致蚕业生产上极大损失。提高家蚕品种对病毒的抵抗性和培育抗病品种是防治传染性蚕病的有效措施。研究家蚕幼虫围食膜与家蚕病核型多角体病毒(BmNPV)之间的相互关系可以为抗性育种提供重要的理论基础。本文通过家蚕幼虫感染病毒后的中肠组织切片观察、扫描电镜观察围食膜的结构变化，探讨家蚕围食膜与BmNPV的相互关系。主要研究内容与结果如下:
　　 1.通过不同浓度（量）BmNPV侵染9个品系家蚕幼虫，调查死亡率，计算出致死中量。最高为SM011，LC50＞1.00×109，最低为SM016，LC50为5.2×106，其余7个品系LC50在1.68×107-1.19×108。最高与最低相差大约103，大多数品系幼虫对BmNPV的经口感染都呈现一定的抵抗力，LC50最低的SM016表现为容易感染BmNPV病毒，SM011表现为经口添食BmNPV时不易感病。再次证实家蚕对BmNPV抗性与敏感性品系的存在。
　　 2.不同浓度荧光增白剂和病毒处理4个品系4龄起蚕，1％荧光增白剂处理4龄起蚕，5-6天后死亡率为65-76％，1％荧光增白剂与低量病毒2.4×104PIBs/头病毒同时处理，2-6天累积死亡率为88％-100％，表明荧光增白剂促进了病毒对幼虫的感染能力。扫描电镜观察到荧光增白剂处理幼虫4小时和8小时时围食膜存在明显的孔洞和缝隙。证实食下荧光增白剂后破坏了家蚕围食膜的结构和完整性，16小时后围食膜表面完整无缝，再次恢复弹性和光滑。围食膜结构和完整性遭到破坏可能是增加病毒对幼虫感染的主要原因。
　　 3.石蜡切片对三个半致死中浓度不同的品系家蚕中肠组织进行观察。结果表明正常家蚕幼虫围食膜是一层厚薄均匀、表面光滑，有弹性的长管状薄膜结构，围食膜几乎布满整个中肠管腔，呈现为多层膜结构。对BmNPV经口感染抵抗性强的品系SM011的中肠细胞分泌物质多少，围食膜结构紧密度，围食膜厚度都大于对BmNPV经口感染抵抗性弱的品种。
　　 4.中肠石蜡切片观察发现，BmNPV经口感染幼虫后不同品系中肠组织细胞出现严重破坏的时间有差异，抗性强的品种在72小时中肠中、后部没有观察细胞破裂核脱落现象，仅有部分中肠细胞核膨大，而抗性弱的品种幼虫中肠细胞细胞核脱落。感染病毒96小时后，三个品种的中肠细胞都出现严重破坏，均出现细胞核脱落。这种细胞破坏时间上的差异，可能与中肠细胞对病毒的感应、应答和自身修复能力有关。
　　 5.扫描电镜观察喂食BmNPV后家蚕及其对照幼虫中肠围食膜表面结构的变化。正常幼虫围食膜表面光滑完整，呈纤维网状结构，无孔洞缝隙。喂食BmNPV后2-3小时围食膜表面明显变化，结构松散，成不规则纤维网状，围食膜有孔洞出现，6小时后围食膜表面恢复规则纤维网状结构，孔洞消失。BmNPV早期的感染过程中，不同品系幼虫围食膜表面破坏时间和修复时间有差异，抗性较弱的SM018围食膜有破坏出现时间为食下2-3小时，观察的恢复时间为6小时;而抗性较强的品种SM011围食膜有破坏出现时间为食下2小时，恢复时间为食下3小时。
　　 6.通常家蚕幼虫感染病毒后24小时后围食膜结构明显改变，表面出现异物或孔洞，48小时孔洞缝隙变大，72小时表面结构破坏更严重。但这个时间在不同品种中有差异，在病毒感染力较弱的品种SM011，孔洞缝隙出现时间是48小时，而SM018出现时间是24小时。该结果表明在病毒复制周期中的第二时相时期，不同品系家蚕中肠组织对病毒的反应不同，可能与宿主细胞自身修复能力有关，细胞分泌能力的严重破坏导致对围食膜的无法修复。
　　 本研究表明家蚕品系中确实存在对BmNPV不同抗性的品种，且差异很大。我们获得了病毒感染初期和后期对宿主中肠组织、围食膜结构影响的组织学证据，这种影响在不同抗性品种中存在很大差异，可能与不同品系中肠对病毒的应激、中肠细胞的免疫应答、自身修复能力有关。本实验结果为理解BmNPV与家蚕的相互作用分子机制奠定了基础。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 昆虫中肠围食膜的特征

1．1．1 昆虫中肠围食膜的组成

1．1．2 昆虫中肠围食膜的形成

1．1．3 昆虫中肠围食膜的类型与特点

1．1．4 昆虫中肠围食膜功能

1．2 昆虫杆状病毒的研究进展

1．2．1 杆状病毒类型

1．2．2 杆状病毒的形态结构

1．2．3 杆状病毒生活史

1．2．4 杆状病毒繁殖周期与宿主对病毒的反应

1．3 昆虫围食膜与昆虫病毒相互关系

1．3．1 病毒穿过昆虫围食膜的方式

1．3．2 家蚕围食膜与病毒的相互作用

第2章 引言

2．1 研究目的和意义

2．2 研究内容

2．2．1 不同品系家蚕幼虫对BmNPV敏感性比较

2．2．2 BmNPV感染对家蚕幼虫中肠组织结构影响

2．2．3 BmNPV感染对不同品系家蚕幼虫围食膜表面结构影响

2．3 研究的技术路线

第3章 不同品系家蚕幼虫对BmNPV敏感性比较

3．1 材料和试剂

3．1．1 供试虫体

3．1．2 家蚕核型多角体病毒(BmNPV)

3．1．3 主要试剂

3．2 方法

3．2．1 幼虫的饲养

3．2．2 死亡率测定与半致死浓度计算

3．2．3 荧光增白剂处理幼虫的围食膜表面结构观察

3．3 结果与分析

3．3．1 BmNPV对不同品系家蚕幼虫的致死率

3．3．2 荧光增白剂处理不同品系家蚕幼虫的致死率

3．3．3 电镜观察荧光增白剂处理幼虫后围食膜表面结构变化

3．4 小结与讨论

第4章 BmNPV感染对家蚕幼虫中肠组织结构影响

4．1 材料和试剂

4．1．1 供试虫体

4．1．2 主要仪器

4．1．3 主要试剂

4．2 方法

4．2．1 载玻片的预处理

4．2．2 家蚕幼虫中肠材料处理

4．2．3 石蜡切片制备与染色

4．3 结果与分析

4．3．1 正常饲养家蚕中肠组织结构

4．3．2 BmNPV感染后不同品系家蚕幼虫中肠组织结构变化

4．4 小结与讨论

第5章 BmNPV感染对家蚕幼虫后围食膜表面结构影响

5．1 材料和试剂

5．1．1 供试虫体

5．1．2 主要仪器

5．1．3 主要试剂

5．2．方法

5．2．1 家蚕幼虫中肠围食膜材料处理

5．2．2 家蚕幼虫中肠围食膜电镜观察

5．3 结果与分析

5．3．1 BmNPV感染家蚕幼虫早期的围食膜结构变化

5．3．2 BmNPV感染家蚕幼虫后期的围食膜结构变化

5．4 小结与讨论

第6章 综合与结论

参考文献

附录

在学期间发表的论文、参研项目和学术交流情况

致谢