检测人可溶性HVEM双抗体夹心ELISA法的建立及部分自身免疫病患者可溶性HVEM的检测

摘要

[目的]
　　 共刺激分子HVEM(herpesvirus entry mediator，HVEM)又称TR2，是新近发现的TNF受体超家族的成员，表达在多种免疫细胞表面，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)及树突状细胞(DC)，扮演一个双相调节T细胞活性的角色，通过与配体LIGHT结合提供给T细胞一个正性刺激信号，通过与免疫球蛋白超家族的成员BTLA结合供给T细胞一个抑制性信号，因此有人将HVEM称作“双向开关”(bidirectionaI Switch)蛋白。研究发现，HVEM分子在肿瘤、自身免疫病及器官移植排斥反应等疾病中扮演重要角色。已证实自身免疫病患者CD4+T细胞异常高表达HVEM和LIGHT，并认为LIGHT/HVEM通路使CD4+T细胞持续活化，在CD4+T细胞辅助下，B细胞产牛大量不同种类的自身抗体，造成组织器官损伤。
　　 本文构建人HVEM(hHVEM)原核表达载体，诱导表达重组hHVEM蛋白，采用重组hHVEM蛋白作为抗原制备兔抗人HVEM多克隆抗体，并建立检测人可溶性HVEM(soluble HVEM，sHVEM)的ELISA夹心法，对部分自身免疫病患者血清sHVEM水平进行检测，以探讨sHVEM的检测对自身免疫病的辅助诊断及病情观察的意义，并为研究HVEM在自身免疫病发生、发展中的作用奠定基础。
　　 [方法]
　　 1.pET-32a/hHVEM原核表达载体的构建
　　 采用分子克隆技术，将人HVEM基因序列克隆插入pET-32a载体，将重组质粒转化至E.coli DH5α，并对重组质粒进行鉴定。
　　 2.His-hHVEM蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
　　 将pET-32a/hHVEM重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导，表达重组His-hHVEM蛋白，采用Ni-NTA亲和层析纯化重组His-hHVEM蛋白，获得大量可溶性His-hHVEM蛋白，采用SDS-PAGE电泳鉴定。
　　 3.兔抗人HVEM多克隆抗体的制备及鉴定
　　 用纯化的重组人HVEM蛋白作为抗原，免疫家兔，制备兔抗人HVEM多克隆抗体，并对其特异性及纯度进行鉴定。
　　 4.hHVEM ELISA检测方法的建立
　　 以抗人HVEM单克隆抗体作为包被抗体，纯化的重组人HVEM蛋白作为参考标准品，兔抗人HVEM多克隆抗体作为捕获抗体，HRP标记羊抗兔IgG作为二抗，建立检测可溶性HVEM的ELISA夹心法。
　　 5.自身免疫病患者血清sHVEM的检测
　　 用建立的检测sHVEM法对12例类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、33例强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、36例系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus，SLE)患者血清sHVEM水平进行检测，并以正常体检者血清sHVEM作为对照，分析自身免疫病患者与正常体检者血清sHVEM浓度的差异。同时采用ELISA法对12例RA和36例SLE患者血清及正常体检者血清IL-17水平进行检测，并对患者组血清sHVEM、IL-17水平进行相关性分析。
　　 [结果]
　　 1.pET-32a/hHVEM原核表达载体的构建
　　 经PCR及测序鉴定，成功构建了原核表达载体pET-32a/hHVEM。
　　 2.His-hHVEM蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
　　 pET-32a/hHVEM重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，DE3表达较高浓度可溶性His-hHVEM蛋白，采用Ni-NTA亲和层析纯化后，经SDS-PAGE电泳鉴定，获得较高纯度的His-hHVEM蛋白。
　　 3.兔抗人His-HVEM多克隆抗体的制备及鉴定
　　 成功制备了兔抗人HVEM多克隆抗体，经过硫酸铵盐析初步纯化后，其ELISA效价为1:12800，多克隆抗体除与重组人HVEM蛋白结合外，还能结合自身免疫病患者血清中HVEM，其纯度及特异度均达到后续试验要求。
　　 4.可溶性hHVEM ELISA检测方法的建立
　　 成功建立了可溶性hHVEM ELISA检测方法，检测范围在7.81μg/L～250μg/L之间，批内和批间变异系数分别为8.03％和13.7％，平均回收率达到了86.3％，说明该方法的准确度和精密度都较好。
　　 5.自身免疫病患者血清sHVEM的检测
　　 用以上建立的方法对12例RA、33例AS、36例SLE患者血清sHVEM水平进行检测，结果显示，SLE、RA及AS患者血清sHVEM水平均高于正常对照组。SLE、RA组患者血清IL-17水平均高于正常对照组，且与其sHVEM血清水平呈正相关。
　　 [结论]
　　 成功构建了pET-32a/hHVEM原核表达载体，成功表达、获得较高纯度的His-hHVEM蛋白；成功制备兔抗人HVEM多克隆抗体，建立了sHVEM ELISA检测方法；初步证实了sHVEM在SLE、RA及AS患者血清中含量增高，提示sHVEM的检测有望作为自身免疫病辅助诊断指标，但有关HVEM在自身免疫性疾病发牛、发展中的作用机制尚需要进一步探讨。