四季海棠(Begonia semperflorens)高频再生及农杆菌介导的遗传转化体系的建立

摘要

四季海棠(Begoniasemperflorens)的很多栽培品种因其性状稳定、花期整齐，观赏效果好而广泛用于城市绿化中。由于四季海棠主要原产南美巴西，其最生长适温度为20℃左右，对低温冷害比较敏感。随着分子生物学技术研究的迅速发展，利用基因工程手段改良四季海棠抗寒性变得切实可行，为提高四季海棠的抗寒性提供了全新的途径。根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）作为遗传转化载体成本低廉、转化效率高，是应用最广泛的外源基因导入法。前人研究发现蜡梅Cpcor413pm1基因转入在烟草中，能有效提高烟草的抗寒性。有关四季海棠遗传转化的研究，目前鲜有报道。本实验在以四季海棠叶片建立再生体系的基础上，以蜡梅Cpcor413pm1基因为外源目的基因，利用根癌农杆菌进行遗传转化，以期获得抗寒能力提高的四季海棠新品种或新材料。主要研究结果如下:
　　 1、四季海棠再生体系建立
　　 以四季海棠幼嫩叶片为外植体，以MS为基本培养基，通过添加不同浓度的6-BA和IBA设计不同的培养基，研究四季海棠叶盘直接分化不定芽的最适分化条件。从而初步建立了四季海棠的再生体系。
　　 外植体叶片表面灭菌方式为:先用洗衣粉溶液(3g/L)漂洗5-6min，流水冲洗4h，然后0.1％升汞灭菌5-6min，无菌水冲洗5-6次。最优不定芽分化培养基为:1/2MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.8mg/L，诱导率达83％;最优继代培养基为:MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.8mg/L，增殖系数为4.7。最优生根培养基为:1/2MS+IBA0.5mg/L，30d左右可诱导出根，生根率可达98％。用珍珠岩∶腐殖质=1∶2作为栽培基质，移栽炼苗成活率91％
　　 2、根癌农杆菌介导的四季海棠遗传转化
　　 在农杆菌EHA105介导转化四季海棠的体系中，卡那霉素（Kanamycin，Km）对四季海棠不定芽分化的筛选压为50mg/L，对再生植株生根的筛选压为100mg/L，羧苄霉素（Carbenicillin，Carb）对农杆菌EHA105的抑制作用优于头孢青霉素(Cephalothin，Cef)，筛选压为200mg/L。
　　 分别从预培养时间、侵染液浓度、侵染时间和共培养时间4个方面，优化四季海棠遗传转化体系。通过GUS基因瞬时表达的检测，结果表明四季海棠叶片在预培养3d、侵染液浓度OD600=0.2、侵染10min、共培养3d后转化效率最高。
　　 共培养培养基为1/2MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.8mg/L+AS100μmol/L;分化筛选培养基为MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.8mg/L+Km50mg/L+Carb200mg/L;生根筛选培养基为:1/2MS+IBA0.5mg/L+Km100mg/L+Carb200mg/L。经过上述方法最终获得32株阳性的转基因四季海棠。
　　 3、低温胁迫下转基因四季海棠植株生理指标的测定
　　 低温(4℃)处理转基因四季海棠与对照植株（野生型）3d后，测定叶绿素、脯氨酸、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)四个生理指标，用以分析蜡梅Cpcor413pm1基因在四季海棠中超表达对其抗寒性的影响，结果表明叶绿素、脯氨酸、丙二醛含量处理前后的变化程度在转基因植株和野生型植株中没有明显差异;野生型植株的SOD活性几乎没有变化，而转基因植株的SOD活性明显增强。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 四季海棠的生物学特性

1．1．1 形态特征

1．1．2 原产地与生态习性

1．2 四季海棠的开发价值

1．2．1 观赏价值

1．2．2 生态价值

1．2．3 药用价值

1．3 四季海棠的生产状况和前景

1．4 四季海棠组织培养的研究概况

1．4．1 四季海棠离体快繁的必要性

1．4．2 外植体的选择

1．4．3 基本培养基的选择

1．4．4 糖原的选择与浓度筛选

1．4．5 激素的选择与浓度筛选

1．5 转基因技术在观赏植物育种中的应用

1．5．1 传统育种与转基因育种

1．5．2 植物遗传改良中常用的转基因方法

1．5．3 观赏植物转基因育种的目标

1．5．4 四季海棠基因工程研究进展

第2章 引言

2．1 研究目的和意义

2．2 技术路线

第3章 四季海棠离体再生体系的建立

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 主要仪器设备及试剂

3．2 实验方法

3．2．1 基本培养基

3．2．2 培养条件

3．2．3 实验设计

3．2．4 数据统计

3．3 结果与分析

3．3．1 外植体的消毒的预备实验

3．3．2 初代培养

3．3．3 继代培养

3．3．4 生根培养

3．3．5 炼苗与移栽

3．4 讨论

3．4．1 外植体的消毒与取材

3．4．2 初代培养

3．4．3 生根培养

3．4．4 继代培养与生根培养的开花现象

3．4．4 炼苗与移栽

第4章 农杆菌介导的四季海棠遗传转化体系的建立

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株与载体

4．1．3 主要生化试剂

4．1．4 主要仪器设备

4．1．5 常用溶液配方

4．1．6 基本培养基

4．2 实验方法

4．2．1 四季海棠对Km的敏感性试验

4．2．2 四季海棠对Cef和Carb的敏感性试验

4．2．3 转化的条件筛选

4．2．4 脱菌与分化筛选培养

4．2．5 生根筛选培养

4．2．6 转基因四季海棠的检测

4．2．7 移栽炼苗

4．2．8 转基因四季海棠的RT-PCR检测

4．3 结果与分析

4．3．1 四季海棠对Km的敏感性试验

4．3．2 四季海棠对Cef和Carb的敏感性试验

4．3．3 转化条件的筛选

4．3．4 脱菌与分化筛选培养

4．3．5 生根筛选培养

4．3．6 转基因四季海棠的GUS染色检测

4．3．7 转基因四季海棠的PCR检测

4．3．8 移栽炼苗

4．3．9 转基因四季海棠的RT-PCR检测

4．4 讨论

4．4．1 基因转化的目的

4．4．2 选择压力的确定

4．4．3 抗生素的使用

4．4．4 提高转化效率的因素

第5章 转蜡梅Cpcor413pm1基因四季海棠的抗寒性分析

5．1 实验材料

5．1．1 植株材料

5．1．2 主要生化试剂

5．1．3 主要仪器

5．1．4 常用溶液配方

5．2 实验方法

5．2．1 低温胁迫处理

5．2．2 生理指标的测定

5．3 结果与分析

5．3．1 丙二醛(MDA)含量的测定

5．3．2 SOD测定

5．3．3 叶绿素含量测定

5．3．4 脯氨酸含量的测定

5．4 讨论

第6章 总结

6．1 结论

6．1．1 四季海棠组织快繁

6．1．2 四季海棠遗传转化

6．1．3 蜡梅Cpcor413pm1基因导入四季海棠的抗寒性

6．2 下一步研究计划

参考文献

缩略词表

致谢

在校期间发表的文章和参与的项目