TA29-Barnase转基因雄性不育芥菜的获得及豌豆花药特异启动子PsEND1功能分析载体构建

摘要

雄性不育作为杂种一代生产最为经济、有效的方法在水稻、玉米、油菜以及部分蔬菜作物中广泛应用。由于具有育种实用价值的天然雄性不育资源较为稀缺，同时不育资源在不同作物中分布不均匀，导致一些农作物杂种优势利用发展缓慢。针对该情况，育种家将解决问题的思路转向通过基因工程创制雄性不育。目前，利用基因工程手段已经在多种植物中获得了雄性不育系，并在油菜、玉米、菊苣等作物中成功商业化应用。芥菜是我国的特产蔬菜之一，虽然近年来利用细胞质雄性不育在芥菜杂种优势育种上取得了一定的进展，但如何发掘、创造优良的芥菜雄性不育材料仍是当前芥菜雄性不育研究的重要内容之一。同时，为保证基因工程雄性不育系育性稳定性，获得一个时空表达严谨的雄性器官特异启动子是关键要素之一。PsEND1启动子（Pisum sativum ENDOTHECIUM1）是一个长度为2.7Kb的豌豆花药特异启动子，该启动子早期在花药原基细胞表达，之后便严格限制在雄蕊原基的表皮、结缔组织、药室内壁和中层细胞等细胞层表达。相对基因工程雄性不育常用的绒毡层启动子，该启动子在花药发育的开始驱动不育基因的表达，在小孢子母细胞分化之前阻止小孢子的发生，最终导致花粉败育。因此，该启动子控制的雄性不育可能败育更为彻底。但目前，有关该启动子的功能区域尚未有研究报道，同时该启动子序列太长也不利于雄性不育基因的遗传操作。针对上述情况，本论文将烟草绒毡层TA29启动子驱动下的Barnase基因通过农杆菌介导法导入“渝丰”榨菜，获得了败育彻底的雄性不育植株，拓宽芥菜雄性不育资源。同时，根据启动子的顺式作用元件的分布情况设计引物，对全长2.7Kb的PsEND1启动子进行5'端缺失，分别与GUS报告基因和Barnase基因构建融合表达载体，转化农杆菌EHA105，并分别转化拟南芥和烟草，获得的主要结果如下:
　　 1.TA29-Barnase转基因雄性不育芥菜植株的获得
　　 (1)将TA29-Barnase用农杆菌介导转化“渝丰”榨菜下胚轴，通过PPT（phosphinothricin，膦丝菌素）的多轮筛选获得转基因芥菜植株。
　　 (2)TA29-Barnase转基因芥菜植株的分子检测
　　 提取转基因植株DNA用TA29-1+BN-2引物进行PCR扩增，结果在5株转基因植株中扩增出预期约630bp大小的DNA片段，表明外源目的基因已整合到芥菜植物基因组中。
　　 (3)转基因芥菜植株的花器官形态
　　 转基因芥菜植株与野生型芥菜植株形态之间无明显差异，但开花时转基因植株与野生型植株相比花朵偏小，并伴随花瓣较小、雌蕊短且粗、雄蕊短缩的现象，同时花药瘦小、干瘪、无花粉囊及花粉。
　　 (4)转基因芥菜植株的花药发育的细胞学观察
　　 通过石蜡切片和显微观察，转基因植株的花药绒毡层细胞提前降解，不能产生有活性的花粉，花药败育。
　　 (5)转基因芥菜植株的结实性
　　 转基因植株开花后，自交花朵的果荚基本不能膨大，部分脱落，无种子形成，用野生型植株花粉授粉后，基本均能结实，但与野生型植株相比果荚较短，不饱满，且种子数少。
　　 2.PsEND1启动子的功能分析载体构建
　　 (1)提取豌豆DNA，利用引物PSE1+PSE2扩增获得预期长度为2.7Kb的PsEND1启动子，测序分析显示获得了正确的PsEND1启动子。
　　 (2)对PsEND1启动子进行5'端缺失，PCR获得五条不同长度的5'端缺失启动子。
　　 分别以PS-2+PS-7;PS-3+PS-7;PS-4+PS-7;PS-5+PS-7;PS-6+PS-7为引物，PsEND1为模板，pfu高保真酶扩增出5个不同长度的启动子片段，将扩增出预期目的片断插入PSK，测序结果正确，依次命名为PSKPS-2、PSKPS-3、PSKPS-4PSKPS-5、PSKPS-6。
　　 (3)不同长度PsEND15'端缺失启动子驱动Barnase基因表达载体的构建
　　 以BN-F+BR-R为引物，PCABARABN-10为模板，pfu高保真酶扩增Barnase及下游的Nos终止子和Bastar基因，PCR产物用NcoI+EcoRI酶切后插入中间载体PBI525后进行测序分析。将PSKPS-2(3、4、5、6)上的不同长度启动子酶切下来替换中间载体上的35S-35S启动子，最后将构好的不同长度的PsEND1缺失启动子及下游的Barnase基因片段用Hind(III)+EcoRI酶切后插入PCABarSN/SCG载体相应位点获得对应的植物表达载体PCABarPS-2Barnase、PCABarPS-3Barnase、PCABarPS-4Barnase、PCABarPS-5Barnase、PCABarPS-6Barnase。上述载体经PCR、酶切检测正确，用液氮冻融法转入农杆菌EHA105。
　　 (4)不同长度PsEND15'端缺失启动子驱动GUS报告基因表达载体的构建
　　 将PB(II)N2-1/GUS载体中的GUS基因及下游的Nos终止子用NcoI+EcoRI替换上述载体中的Barnase基因，获得PCABarPS-2Gus、PCABarPS-3Gus、PCABarPS-4Gus、PCABarPS-5Gus、PCABarPS-6Gus表达载体。上述载体经PCR、酶切检测均正确，用液氮冻融法转入农杆菌EHA105。
　　 (5)将PCABarPS-2Gus、PCABarPS-3Gus、PCABarPS-4Gus、PCABarPS-5Gus、PCABarPS-6Gus表达载体分别用“浸花法”法转化拟南芥，叶盘转化法转化烟草，已获得部分转化后代，为后续PsEND1启动子的功能分析奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物雄性不育的研究

1．2 基因工程创造雄性不育的方法

1．2．1 特异表达细胞毒素基因阻断花粉发育过程获得雄性不育

1．2．2 干扰或抑制花药发育过程中的关键酶

1．2．3 利用胼胝质酶提前降解胼胝质

1．2．4 通过组成型表达获得植物雄性不育系

1．2．5 利用线粒体相关基因创造基因工程雄性不育

1．2．6 基因工程方法制备雄性不育及其相应育性恢复的两用系

1．3 芥菜雄性不育的研究进展

1．4 启动子的定义和特征

1．5 启动子的种类

1．5．1 组成型启动子

1．5．2 组织特异性启动子

1．5．3 诱导型启动子

1．6 启动子功能分析的方法

1．6．1 生物信息法

1．6．2 实验分析法

1．7 PsEND1启动子

第二章 引言

2．1 研究的目的与意义

2．2 研究内容

2．2．1 TA29-Barnase转基因雄性不育芥菜的获得

2．2．2 豌豆花药特异启动子PsEND1的功能分析载体构建

第三章 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 实验材料

3．1．2 试剂与药品

3．1．3 主要缓冲液

3．1．4 细菌培养基

3．1．5 主要仪器设备

3．1．6 主要引物

3．2 实验方法

3．2．1 TA29-Barnase转基因雄性不育芥菜的获得

3．2．2 PsEND1启动子的克隆及缺失启动子的获得

3．2．3 拟南芥的遗传转化

3．2．4 农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草

第四章 结果与分析

4．1 TA29-Barnase融合基因转化芥菜

4．1．1 TA29-Barnase转基因芥菜植株的获得

4．1．2 TA29-Barnase转基因芥菜植株的花器官形态

4．1．3 TA29-Barnase转基因芥菜植株的花药发育的细胞学观察

4．1．4 转基因芥菜植株的结实性

4．2 PsEND1缺失启动子表达载体的构建

4．2．1 PsEND1启动子的克隆

4．2．2 PsEND1启动子主要顺式作用元件分析

4．2．3 不同长度的5’端缺失启动子的构建

4．2．4 不同长度豌豆PsEND1 5’端缺失启动子驱动Barnase基因表达载体的构建

4．2．5 不同长度豌豆PsEND1 5’端缺失启动子驱动GUS基因表达载体的构建

4．2．6 将构建好的10个载体转化农杆菌EHA105

4．2．7 融合表达载体侵染拟南芥和烟草

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

附录

在学期间所发表的论文以及参加的项目