蜡梅八氢番茄红素脱氢酶基因CpPds的克隆与表达分析

摘要

类胡萝卜素(Carotenoids)是自然界中最丰富的萜类色素物质，广泛存在于细菌、真菌以及植物中。迄今为止，在自然界中已经发现了750多种类胡萝卜素。类胡萝卜素主要是作为光合生物光合膜的重要组成成份来行使其功能的。它在光合作用中发挥着重要的作用。类胡萝卜素也是很多花和果实中的主要色素。1950年，Porter和Lincoln首先提出了高等植物类胡萝卜素生物合成途径，目前植物类胡萝卜素生物合成过程中几乎所有的基因都已经分离和鉴定出来了。八氢番茄红素脱氢酶(Phytoenedehydrogenase)是催化类胡萝卜素生物合成过程中的主要限速酶，催化无色的八氢番茄红素(Phytoene)脱氢，生成番茄红素(Lycopene)，进而转变为有色的类胡萝卜素。八氢番茄红素脱氢酶位于叶绿体的类囊体膜上，对叶绿体起到一种特殊的保护作用。当编码该蛋白的基因被沉默，叶绿体失去了这种酶的保护作用，导致叶绿素降解，富含叶绿素的叶片等组织斑驳、褪色、黄化甚至变成白色，此种现象就称为光漂白现象。这种表型很容易分辨。所以八氢番茄红素脱氢酶基因常作为近年来新兴发展的病毒诱导的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing，VIGS)体系的报告基因。蜡梅八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆，为下一步在蜡梅中建立VIGS体系打下基础。
　　 本论文根据已知的八氢番茄红素脱氢酶基因的同源序列，通过简并PCR结合RACE技术，克隆得到蜡梅八氢番茄红素脱氢酶基因的全长cDNA。命名为CpPds，(Genbankaccession:KC814175)。通过对该基因和其所编码的蛋白进行序列特征分析;荧光定量PCR检测CpPds在蜡梅不同组织和不同时期的转录表达水平;构建植物超表达载体，获得转基因烟草植株，对CpPds进行功能的初步研究。主要的研究结果如下:
　　 1.蜡梅CpPds基因的克隆和生物信息学分析
　　 根据已知的八氢番茄红素脱氢酶基因的同源序列，设计简并引物，通过简并PCR方法获得蜡梅八氢番茄红素脱氢酶基因cDNA的核心片段。以此片段为基础，通过RACE方法，克隆得到该基因的两端片段。根据拼接得到的电子全长，设计全长引物，最终克隆得到蜡梅八氢番茄红素脱氢酶基因cDNA的物理全长。蜡梅Pds基因cDNA全长2242bp，ORF框为1716bp，编码一个含有571个氨基酸的蛋白质。蛋白的分子量为64.28kD，预测的理论等电点值为7.94。在NCBI上对CpPds编码的蛋白质进行保守结构域同源性分析，表明CpPDS蛋白属于NAD结合蛋白。蛋白编码区序列在各个物种中表现出较高的同源性，可以说明八氢番茄红素脱氢酶基因作为功能基因在进化中比较保守。在CpPds编码的蛋白序列与其他植物的PDS蛋白序列之间构建NJ进化树，结果显示蜡梅PDS蛋白在进化上介于双子叶和单子叶植物之间，且与两种单子叶植物的PDS蛋白的遗传距离较近，可能是蜡梅PDS蛋白比较保守，在进化上处于较低等的位置。信息学分析表明，该蛋白无信号肽，没有跨膜结构域，含有38潜在的个苏氨酸(Thr)磷酸化位点，属于比较稳定的亲水性蛋白，亚细胞定位预测显示该蛋白最可能在线粒体基质中发挥作用。
　　 2.CpPds基因的转录水平分析
　　 分析CpPds在蜡梅不同组织和花发育不同时期的表达水平，结果表明CpPds基因在蜡梅各个组织和花发育不同时期均有表达，说明该基因可能是组成型表达。伴随着花朵逐渐开放到衰老，其表达量呈现整体升高的趋势，在衰败期达到峰值。推测CpPds基因编码的蛋白可能与蜡梅花器官的衰老有关，在蜡梅花衰老过程中调节着类胡萝卜素的积累。相对于花和叶片的高表达量，在茎中的表达量较低，且除雌蕊外，在外瓣、中瓣、内瓣、雄蕊中的表达量都相当且较高，说明CpPds参与蜡梅花的发育过程。推测CpPds基因在蜡梅花类胡萝卜素积累和花的显色中可能起着重要作用。
　　 3.CpPds在转基因烟草中的超表达
　　 构建植物超表达载体pCAMBIA2301g-CpPds，并转化农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的叶盘法将pCAMBIA2301g-CpPds转入烟草植株中，通过抗性筛选、Gus组织化学染色、PCR扩增等方法鉴定转基因烟草植株。以野生型烟草为对照，对转基因烟草中目的基因CpPds进行实时荧光定量PCR检测，并测定叶片中的番茄红素的含量，结果表明转基因烟草叶片中的番茄红素含量全部高于野生烟草，且与目的基因的超量表达呈正相关关系。进一步证明克隆得到的蜡梅CpPds基因是其番茄红素合成途径上一个重要的关键酶的编码基因。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 类胡萝卜素概述

1．1．1 类胡萝卜素的功能简介

1．1．2 植物类胡萝卜素

1．1．3 植物类胡萝卜素的生物合成途径

1．1．4 植物类胡萝卜素合成过程中的关键酶

1．1．5 番茄红素

1．2 八氢番茄红素脱氢酶(PDS)简介

1．3 蜡梅研究简介

第二章 引言

2．1 研究背景

2．2 研究的目的和意义

2．3 研究的技术路线

第三章 CpPds基因的克隆与分子特性分析

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株与载体

3．1．3 试剂盒及主要试剂

3．1．4 主要仪器和设备

3．1．5 自配的主要试剂

3．2 试验常规方法介绍

3．2．1 蜡梅花基因组DNA的提取

3．2．2 蜡梅总RNA的提取

3．2．3 蜡梅cDNA第一链的合成

3．2．4 蜡梅cDNA RACE模板的合成

3．2．5 DNA目的片段的回收

3．2．6 连接反应

3．2．7 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

3．2．8 重组子的鉴定和测序

3．3 蜡梅CpPds基因的克隆及生物信息学分析

3．3．1 利用简并RT-PCR方法获得CpPds基因片段序列

3．3．2 蜡梅cpPds基因5’片段和3’片段的获得

3．3．3 蜡梅CpPds基因全长cDNA序列的克隆

3．3．4 CpPds基因的生物信息学分析

3．4 结果与分析

3．4．1 蜡梅花总RNA的提取

3．4．2 CpPds基因的克隆

3．4．3 CpPds基因全长cDNA及其编码蛋白的生物信息学分析

3．5 讨论

第四章 蜡梅CpPds基因的实时荧光定量表达分析

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料及生长条件

4．1．2 主要试剂和设备

4．2 实验方法

4．2．1 材料总RNA的提取

4．2．2 cDNA第一链的合成

4．2．3 CpPds基因在蜡梅不同组织及不同时期的表达的荧光定量分析

4．3 实验结果与分析

4．3．1 总RNA提取

4．3．2 熔解曲线分析

4．3．3 标准曲线分析

4．3．4 蜡梅CpPds基因在蜡梅花朵不同时期及不同组织中的荧光定量分析

4．4 讨论

第五章 植物表达载体的构建及烟草的遗传转化

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料

5．1．2 菌株与载体

5．1．3 常用药品试剂配制

5．2 植物表达载体pCAMBIA2301g-CpPds的构建

5．2．1 引物设计

5．2．2 目的片段PCR扩增

5．2．3 PCR产物的回收

5．2．4 回收片段连接克隆载体

5．2．5 转化大肠杆菌DH5α

5．2．6 转化子的PCR鉴定

5．2．7 pMD19-T／CpPds质粒提取

5．2．8 表达载体pCAMBIA2301g的制备

5．2．9 酶切质粒回收目的片段

5．2．10 目的基因片段与表达载体的连接：(16℃连接20-22h)

5．2．11 转化大肠杆菌DH5a

5．2．12 转化子的鉴定

5．3 烟草的遗传转化

5．3．1 制备电转化农杆菌GV3101感受态细胞

5．3．2 电转法转化农杆菌感受态

5．3．3 阳性转化子鉴定

5．3．4 CpPds基因的烟草遗传转化

5．4 转基因烟草植株的鉴定

5．4．1 转基因植株的Gus活性组织化学染色检测

5．4．2 转基因植株PCR检测

5．4．3 转基因烟草荧光定量PCR检测

5．4．4 转基因烟草的番茄红素含量的测定

5．5 结果与分析

5．5．1 CpPds基因片段的制备

5．5．2 植物表达载体pCAMBIA2301g-CpPds的鉴定

5．5．3 转基因烟草的获得

5．5．4 转基因烟草的检测

5．6 讨论

第六章 总结

6．1 小结

6．1．1 蜡梅CpPds分子克隆及其分子特性特征

6．1．2 CpPds的转录表达分析

6．1．3 CpPds在模式植物烟草中的超量表达

6．2 下一步工作计划

参考文献

缩略词表

致谢