家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究——家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶NbSLP2的定位及功能初探

摘要

微孢子虫作为专性的细胞内寄生生物，其生活史的完成必须严格依赖于宿主提供的营养和能量。家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原，其侵染和致病机理目前仍不清楚。普遍的观点认为，家蚕微孢子虫通过释放蛋白酶，水解寄主细胞内容物，掠夺宿主营养物质，完成其在宿主家蚕细胞内的增殖。因此，分泌性蛋白酶被认为是致病性真菌重要的毒力因子。这些蛋白酶不仅参与孢子的入侵过程，还可以与宿主的免疫系统相互作用。类枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin-like protease，SLP)为丝氨酸蛋白酶家族成员，广泛存在于细菌、真菌和寄生虫等生物中。近年研究表明，类枯草杆菌蛋白酶与病原性细菌、真菌的致病性相关，在真菌孢子形成、蛋白质降解及细胞自噬等方面起着非常重要的作用。随着家蚕微孢子虫基因组测序的完成，通过序列比对发现在家蚕微孢子虫中也存在类枯草杆菌蛋白酶。因此，我们推测家蚕微孢子虫可能在入侵过程中会分泌类枯草杆菌蛋白酶，通过降解昆虫体壁帮助其入侵宿主细胞。基于此，本研究在已鉴定报道的三个类枯草杆菌蛋白酶基因（Nbslp1，Nbslp2-1和Nbslp2-2）的基础上，分析了第二个类枯草杆菌蛋白酶基因Nbslp2的序列特征和转录情况，并对其进行了原核克隆表达和抗体制备，利用制备的抗体对提取到的家蚕微孢子虫膜蛋白和总蛋白进行了免疫印迹分析，随后采用间接免疫荧光及免疫共沉淀技术对NbSLP2的亚细胞定位和功能进行了初步探索。主要研究结果如下:
　　 1.家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶基因Nbslp2的序列特征及转录情况分析
　　 NbSLP2具有557个氨基酸，预测蛋白质分子量为63.84kDa，等电点为7.29，不具有抑制结构域，具有Peptidase_S8结构域。C端第494～516位氨基酸为跨膜结构域。有4个糖基化位点，推测家蚕微孢子虫NbSLP2可能为糖蛋白。亚细胞定位预测显示NbSLP2不仅具有膜定位信号，可能也会分泌到胞外发挥作用。此外，以感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠组织为材料的转录活性分析表明，Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72h检测到转录，并且该转录活性会随着感染时间的延长有逐渐减弱的趋势，暗示Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥重要作用。
　　 2.家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶NbSLP2的原核表达、抗体制备及免疫印迹分析
　　 对Nbslp2的全长基因和去除跨膜结构域的Nbslp2(TM-)基因进行原核表达。以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，得到Nbslp2和Nbslp2(TM-)，并将目的片段构建到表达载体pET30a中，进行原核表达。NbSLP2融合蛋白与预测的偏大近21kDa，推测可能是由于蛋白本身的修饰造成的;而NbSLP2(TM-)融合表达蛋白与预测分子量相符，该蛋白不仅表达量比较高，而且主要以可溶形式表达。利用纯化的重组蛋白免疫小鼠，获得了相应的多克隆抗体。经效价测定，制备得到的多克隆抗体能够满足后续的实验。
　　 免疫印迹分析显示，在家蚕微孢子虫总蛋白中检测到了一条特异的、分子量大小与NbSLP2预测一致的蛋白质条带。由于家蚕微孢子虫Nbslp2预测有跨膜结构域，暗示着其可能是一个膜蛋白，为了验证NbSLP2是否为膜蛋白，我们采用破碎抽提异步法提取到了家蚕微孢子虫膜蛋白组分，利用该组分进行westernblotting，检测到相应的蛋白条带，且杂交信号比总蛋白中的信号强，进一步说明NbSLP2极有可能是一个膜蛋白。
　　 3.家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶NbSLP2的亚细胞定位分析
　　 应用间接免疫荧光技术对NbSLP2在家蚕微孢子虫成熟孢子与发芽孢壳内的亚细胞定位特点进行了研究。在成熟家蚕微孢子虫中，荧光信号分布于孢壁周围，暗示NbSLP2在成熟的家蚕微孢子虫体内有表达;再经NbSLP1C和NbSLP2(TM-)两种不同来源的抗体同时标记后，进行荧光信号叠加的结果发现它们的定位信号分布于孢子虫体两端，推测NbSLP2和NbSLP1在孢子体内一起发挥着协同作用。发芽孢壳的IFAT结果表明NbSLP2蛋白在孢壳中有信号，且定位特征较为明显，呈点状分布于孢壳的两端或一端。这一定位结果与已报道的家蚕微孢子虫NbSLP1的定位结果相似;进一步的共定位结果显示，NbSLP2与NbSLP1有部分定位信号能够重合，而未能重合的信号分布于孢壳的质膜上，提示NbSLP2不仅是一个膜蛋白，可能会经过一定的分泌途径分泌到孢子外面，与NbSLP1一起在极丝弹出的位置发挥蛋白水解功能，共同参与极丝弹出过程。
　　 4.感染家蚕微孢子虫的BmE细胞中NbSLP2的检测
　　 利用间接免疫荧光技术检测感染家蚕微孢子虫的家蚕BmE细胞中NbSLP2的表达。结果显示，荧光信号分布于孢子内部及感染细胞的周围，暗示着NbSLP2不仅是一个膜蛋白，而且可能会分泌到孢外发挥作用;进一步的共定位结果显示，NbSLP2与NbSLP1蛋白有部分定位信号能够重合，暗示这两个蛋白酶在孢子入侵宿主细胞或在宿主细胞体内增殖的某段时期内可能具有协同作用或发挥着相同的功能。免疫印迹分析显示，在感染家蚕微孢子虫BmE细胞总蛋白的上清中检测到了NbSLP2蛋白，表明NbSLP2能分泌至宿主细胞内发挥功能。
　　 5.家蚕微孢子虫NbSLP2的功能初探
　　 本章主要利用免疫共沉淀技术寻找NbSLP2在家蚕微孢子虫内的互作靶蛋白。将差异性条带进行质谱鉴定，得到两个可能的候选靶蛋白，分别是NBO_48g0012和NBO_34g0016，但从覆盖度，分子量大小以及匹配上的肽段数来分析，NBO_48g0012基因比较符合目的条带。该基因在其基因组数据库中没有找到注释信息。该序列与其它种属的微孢子虫序列进行比对后，发现该基因含有典型的septin结构域，因此将该基因命名为家蚕微孢子虫Nbseptin基因。Septin在绝大多数真核生物和哺乳动物中都参与了胞质分裂。据报道，酵母的septin定位于出芽的芽颈处。为了进一步验证Nbseptin与NbSLP2的互作，我们借助模式生物酵母对该基因进行了定位研究，结果发现，Nbseptin能定位到酵母出芽的芽颈处及下一个即将出芽的位置，并且Nbseptin组装过程总是沿着酵母内膜向出芽芽体的顶端聚集，这一定位特征与NbSLP2的分布相似，暗示NbSLP2可能参与了Nbseptin的剪切加工成熟。但NbSLP2与Nbseptin是如何互作的等等一系列的问题还有待深入研究。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 微孢子虫研究进展

1．1．1 微孢子虫概述

1．1．2 微孢子虫的超微结构及生活史

1．1．3 微孢子虫的侵染机制

1．2 家蚕微孢子虫分泌蛋白研究进展

1．3 枯草杆菌蛋白酶概述

1．3．1 枯草杆菌蛋白酶简介

1．3．2 枯草杆菌蛋白酶的研究进展

1．4 枯草杆菌蛋白酶在微孢子虫中的研究进展

第二章 引言

2．1 研究背景

2．2 研究目的和意义

2．3 主要研究内容

2．4 研究技术路线

第三章 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的序列及转录分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 主要方法

3．2 结果与分析

3．2．1 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2基因的基本性质

3．2．2 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2基因的共线性分析

3．2．3 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2基因的亚细胞定位预测

3．2．4 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2基因的二级结构及功能域预测分析

3．2．5 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2基因的转录活性分析

3．3 结论与讨论

第四章 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2基因的克隆表达及定位分析

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 主要试剂与仪器

4．1．3 主要方法

4．2 结果与分析

4．2．1 家蚕微孢子虫Nbslp2基因的原核表达及抗体制备

4．2．2 家蚕微孢子虫NbSLP2的免疫印迹分析

4．2．3 家蚕微孢子虫NbSLP2的亚细胞定位分析

4．2．4 感染家蚕微孢子虫BmE细胞中NbSLP2的检测

4．3 结论与讨论

第五章 家蚕微孢子虫NbSLP2的功能探索

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 主要试剂与仪器

5．1．3 主要方法

5．2 结果与分析

5．2．1 家蚕微孢子虫NbSLP2的互作蛋白研究

5．2．2 质谱鉴定蛋白Nbseptin在酿酒酵母中的定位研究

5．3 结论与讨论

第六章 综合与结论

参考文献

在读期间发表的文章及参研课题

附录

致谢