双功能融合蛋白RDP-BDNF的制备及其对东莨菪碱所致认知功能障碍小鼠的作用

摘要

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是脑内广泛存在的一种蛋白质，由脑组织合成，主要存在于中枢神经系统，尤以上丘脑、海马、大脑皮层和纹状体部位含量最高。BDNF在中枢神经系统发育中起重要作用，能够维持多种神经元的存活、分化及生长发育，并促进受损神经元的恢复与再生，对突触间经典递质的释放有增强作用，影响神经元的可塑性。研究发现，BDNF含量和分布的变化与很多神经退行性疾病的发病机制有很大关系，且向脑内补充外源性BDNF对神经退行性疾病有治疗作用。血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)主要由脑毛细血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothilial Cells，BMECs)及其之间的紧密连接组成，若外源性物质要通过BBB必须满足两个条件:1）分子量必须小于500Da;2）脂溶性高。由于BDNF属于大分子阳离子蛋白质，外源性BDNF很难通过血脑屏障而发挥作用，因此，如何将外源性BDNF蛋白转运入脑仍是一项挑战。迄今为止，克服BBB的中枢系统给药方法包括两类:其一是侵入性给药方法;包括脑内定位注射、脑室内或海马穿刺给药、脑部移植工程化细胞等，然而该类方法因其缺点:药物很快被组织清除、不易扩散、浓度梯度大、技术要求高、风险大等而不能应用于临床。其二是非侵入性给药方法;该类方法通过载体的介导将生物大分子转运入脑，其具有高效、低毒、安全、方便等优点。
　　将蛋白质或多肽载体与外源性大分子物质通过基因工程的方法连接，在工程菌中表达融合蛋白，可以实现载体协助大分子物质进行入脑转运。狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)具有嗜神经性，能够携带其他物质向中枢神经系统转运。序列分析显示，RVG上的189-214和330-357氨基酸序列是病毒与神经元连接的关键部位，我们将330-357这段序列与含九个精氨酸的膜转导肽(cell penetrating peptides，CPPs)通过3个甘氨酸连接后形成RVG衍生肽(RVG-derived peptide, RDP(KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGGGRRRRRRRRR))。RDP能够携带多种大分子蛋白质穿过血脑屏障并发挥生物学作用。本文试图通过基因工程的方法将RDP基因与BDNF基因融合并在大肠杆菌中诱导表达，将融合蛋白经尾静脉注射入小鼠体内，通过ELISA法检测RDP介导的BDNF蛋白在小鼠体内的分布，采用Morris水迷宫的方法探究RDP-BDNF对东莨菪碱所致认知障碍模型小鼠的作用，并研究其作用机理。实验结果表明，重组的RDP-BDNF能够跨血脑屏障并发挥其神经营养活性，能改善东莨菪碱诱导的认知功能障碍小鼠的学习记忆能力，其作用机制可能与提高认知障碍模型小鼠脑内BDNF水平，从而增强胆碱能神经系统的功能及维持氧化应激状态平衡有关。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 BDNF作用机制及传导通路

1．2 BDNF与神经发育

1．3 BDNF对突触传递的影响

1．4 BDNF与神经再生

1．5 BDNF与学习记忆

1．6 BDNF与癫痫

1．7 BDNF与疼痛

1．8 BDNF与神经退行性疾病

1．8．1 对AD的作用

1．8．2 对PD的作用

1．8．3 其他

第二章 绪论

第三章 融合蛋白的原核表达及SDS-PAGE

3．1 实验材料

3．1．1 菌种与载体

3．1．2 主要仪器和试剂

3．1．3 主要试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 载体构建

3．2．2 融合蛋白的原核表达、Folin-酚法测总蛋白含量及SDS-PAGE

3．3 结果

3．3．1 PCR菌落鉴定结果

3．3．2 酶切鉴定结果

3．3．3 基因测序图谱片段

3．3．4 标准曲线的绘制

3．3．5 SDS-PAGE

3．4 结论与分析

第四章 RDP-BDNF对东莨菪碱所致认知功能障碍小鼠的作用

4．1 实验材料

4．1．1 试验动物

4．1．2 主要仪器及试剂

4．2 实验方法

4．2．1 RDP介导的BDNF在小鼠体内的分布

4．2．2 AD模型鼠的制备及RDP-BDNF治疗

4．2．3 生化测定

4．2．4 统计学处理

4．3 结果

4．3．1 RDP-BDNF在小鼠大脑和血清中的时效曲线

4．3．2 RDP-BDNF融合蛋白对东莨菪碱所致认知障碍小鼠学习记忆的影响

4．3．3 RDP-BDNF的作用机理

4．4 结论与分析

参考文献

英文缩略语名词对照

在校成绩

附录

致谢