粘质沙雷氏菌次生代谢产物灵菌红素的生理与生物学活性的研究

摘要

灵菌红素prodiginine是含有三个吡咯环结构的天然红色素家族的统称，具有抗细菌、抗真菌、抗原虫、抗疟疾、抗肿瘤及免疫抑制等多种生物学活性并可作为天然染料，应用前景广泛。然而由于化学结构的不同，灵菌红素表现出的生物学活性有较大的差异。本研究从灵菌败血症病蚕血淋巴中分离得到一株产灵菌红素的粘质沙雷氏菌SCQ1。首先，利用SCQ1为家蚕病原微生物的特性，以蚕蛹为主要碳氮源，优化发酵条件提高灵菌红素产量，纯化并鉴定了其化学结构。其次，结合灵菌红素的理化性质研究并提出了灵菌红素生理学功能的假说。最后，研究了SCQ1菌株灵菌红素抗细菌、抗真菌、抗癌以及抗家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedroviruses，BmNPV)的生物学活性。
　　1.粘质沙雷氏菌SCQ1的分离、鉴定与发酵
　　灵菌红素产量较小，目前国际市场上仅有标准品出售，价格约为500 USD/mg，严重制约了其应用开发。本研究从灵菌败血症病蚕血淋巴中分离得到产红色素菌株SCQ1，经鉴定为粘质沙雷氏菌，并通过科赫法则进行验证。经单因子试验确定SCQ1菌株的最适培养温度为28℃C，最适pH为6.5-8.0，发酵时间为56h，最适碳源为甘油，最适氮源为酵母膏，微量元素中钙元素可提高红色素产量。进一步通过最陡爬坡试验分别确定甘油、酵母膏和钙元素的最适范围，采用Box-Behnken法设计3因子试验，建立二次响应面回归模型，分析得到培养基最佳配方为14.25 g/L甘油、14.02 g/L酵母膏和25.75μmol/L CaCl2，红色素理论最高产量为986.78 mg/L。红色素实际产量经验证为974.76±15.33 mg/L，是初始发酵培养基的2.04倍。
　　为了降低灵菌红素发酵的生产成本，本研究利用SCQ1菌株为家蚕致病菌这一特性，选择蚕蛹作为主要碳氮源发酵产红色素。通过测量生长曲线发现SCQ1菌株在只含蚕蛹匀浆液的培养基中生长缓慢，发酵时间延长至112 h，但红色素产量相对较高，约为667.23±15.33mg/L，因此采用添加碳氮源的方式加速SCQ1菌株的发酵进程。单因子试验确定最适氮源为酵母膏，最适碳源为蔗糖，发酵时间为72 h。通过最陡爬坡试验确定上述因素的最适范围，Box-Behnken法设计3因子试验，建立二次响应面回归模型，分析得到培养基最佳配方为酵母膏6.36 g/L，蔗糖4.22 g/L，蚕蛹匀浆液16.24 g/L，红色素理论最高产量为2，020.66 mg/L。红色素实际产量经验证为1，916.08±13.33 mg/L，是未优化蚕蛹培养基的2.87倍，是优化后酵母膏甘油培养基的1.97倍。本研究分离得到的粘质沙雷氏菌SCQ1菌株适合发酵蚕蛹生产灵菌红素，产量约为1.9 g/L，有希望作为工业发酵菌株，也有利于蚕蛹资源的综合利用。
　　2.灵菌红素的分离、纯化与检测
　　灵菌红素家族包含多种结构类似物，本研究纯化并检测了家蚕灵菌败血症病原菌SCQ1菌株所产灵菌红素的化学结构。试验证实灵菌红素不溶于水，主要存在于发酵液沉淀中，通过甲醇氯仿混合液(95∶5，v/v)萃取菌体沉淀可获得灵菌红素粗提物。以石油醚乙酸乙酯(1∶1，v/v)为层析液进行薄层色谱检测，红色素Rf值约为0.6左右，与灵菌红素prodigiosin的报道相符。采用柱色谱进行纯化，经真空浓缩，冷冻干燥后得深红色，表面具有绿色反光的高纯度灵菌红素固体。研究显示，灵菌红素在pH2-3的溶液中为紫红色，pH7.2-7.4为橙红色，pH10-12为黄色，其最大吸收峰随颜色的变化发生偏移。高效液相色谱检测显示所制备的灵菌红素样品纯度约为95.8％，质谱分析显示灵菌红素样品可能存在结构极其相似的同系物。进一步通过高分辨傅立叶变换离子回旋共振质谱分析，确定样品分子量[M+H]+324.2071，与灵菌红素prodigiosin(C20H25N3O)一致。原子吸收光谱检测显示，每克灵菌红素样品中约含38.4μg钙元素，并含有其它痕量元素。试验确定了家蚕病原粘质沙雷氏菌SCQ1所产红色素的主要成分为prodigiosin(CAS No.82-89-3)，为其应用提供了基础数据。
　　3.粘质沙雷氏菌灵菌红素的生理学功能
　　许多微生物能产生含有吡咯结构的次生代谢产物，如prodiginine和tambjamine，但这些代谢产物的生理学功能尚不清楚，未得到合理的解释。本研究通过显色反应定性判断灵菌红素与多种金属离子可在中性pH条件下发生作用，并发现灵菌红素的锌离子配合物具有显著的黄色至橙色荧光效应，推测灵菌红素可络合金属离子，可能与粘质沙雷氏菌对金属离子的耐受性有关。进一步采用平板扩散试验，通过对比无色素SCQ1-W突变株，发现灵菌红素可在一定程度上提高粘质沙雷氏菌对过量Cu2+的耐受性。然而菌体内富集高浓度的金属离子或累积过量的灵菌红素显然具有一定的毒性，因此我们研究了灵菌红素的存在形式与分泌方式。结果显示，灵菌红素在粘质沙雷氏菌的菌落中分布不均匀，其中在菌落中心表层可以固体形式析出，整体呈年轮状分布，延长培养时间可观察到灵菌红素分泌至菌落外。进一步发现灵菌红素在菌落内集中分布于类似囊泡的结构中，并首次观察到灵菌红素在特定生长阶段以色素团的形式分泌至菌落外。色素团在培养基表层移动一定距离后破裂，内部包含的灵菌红素缓慢扩散。研究表明灵菌红素并不在菌体内累积，而是通过特殊的方式分泌至体外，可能与金属离子的代谢密切相关。随后，我们发现正常培养条件下，粘质沙雷氏菌分泌至菌落外的灵菌红素，以及外源添加的高浓度灵菌红素不影响菌落生长，表明胞外高纯度的灵菌红素对粘质沙雷氏菌无抑制作用。最后，我们通过添加Mn2+(促进菌体生长)或Cu2+(抑制菌体生长)，发现灵菌红素涉及细菌菌落中金属离子的传递。一方面，灵菌红素传递有害的Cu2+至菌落外，菌落接触后生长受到抑制并在边缘处形成凹陷，随后在菌落内部形成中空无菌区域。另一方面，灵菌红素同样可传递有利的Mn2+至菌落外，菌落接触后生长受到刺激并形成明显凸起。
　　上述结果表明，粘质沙雷氏菌合成灵菌红素有助于提高对金属离子的耐受性，同时有助于金属离子在菌群内的传输与分配。据此，本研究首次提出灵菌红素具有结合并传递金属离子的生理功能，即灵菌红素是粘质沙雷氏菌金属离子储存库的假说，其生理学意义是提高细菌对微量元素的竞争力与环境的适应性。
　　4.粘质沙雷氏菌灵菌红素的抗菌与抗癌活性
　　国际上对灵菌红素prodigiosin(C20H25N3O)抗菌活性的报道不一致，可归咎于被测菌株、纯化方法及测试方法差异等多种原因。鉴于部分产灵菌红素微生物可产生抗生素类物质，而大量研究采用灵菌红素粗提物进行抗菌试验，结果可能存在假阳性。本研究采用纯化的灵菌红素，结果显示对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、耐药性大肠杆菌等多株临床病原细菌以及枯草芽孢杆菌均无显著抑制作用。灵菌红素对白色假丝酵母和疣状瓶霉有轻微抑制作用，对新型隐球菌、构巢曲霉和尖端赛多孢子菌无抑制作用。因此，灵菌红素prodigiosin(C20H25N3O)对多种临床病原细菌和真菌均没有显著的抑制作用，其抗菌活性不值得作为新型抗生素加以开发。
　　根据2012年中国癌症登记年报，肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌是我国高发癌症，分别占癌症发病人数的18.74％、12.67％、10.30％、10.04％和7.74％，其中死亡率最高的3种癌症分别是肺癌、肝癌和胃癌。根据文献报道，灵菌红素prodigiosin对不同癌细胞的抗癌活性存在显著差异，而目前尚不知prodigiosin(CAS No.82-89-3)对多个癌细胞系，如对胃癌细胞系MGC803和SGC7901等的活性强弱，也不知其对人体正常细胞的细胞毒性大小。本研究显示灵菌红素对人肺癌细胞系A549，肝癌细胞系HepG2，胃癌细胞系MGC803及SGC7901有显著的抑制作用，其半数抑制浓度分别为6.81，8.23，15.62，0.37μmol/L。美国癌症研究所公布的数据显示，灵菌红素对60株人癌细胞系的平均半数抑制浓度约为2.08μmol/L。本研究发现灵菌红素对人骨髓间充质干细胞半数抑制浓度约为26.93μmol/L，暗示灵菌红素对癌细胞存在选择性细胞毒性。通过连续观察发现灵菌红素可快速进入癌细胞内并大量累积，进一步通过流式细胞分析发现灵菌红素可诱导癌细胞发生凋亡，但凋亡细胞比例始终维持在较低水平而死亡细胞比例快速提高。其中灵菌红素为5 mg/L时，A549细胞死亡率可从4h的11.2％急剧上升至20h的94.3％。
　　我们的研究发现家蚕病原粘质沙雷氏菌的灵菌红素prodigiosin(CAS No.82-89-3)对人骨髓间充质干细胞的毒性较低，证实其对癌细胞具有选择性的细胞毒性，可诱导癌细胞发生凋亡并在短时间内导致癌细胞死亡。
　　5.粘质沙雷氏菌灵菌红素抗BmNPV的活性
　　BmNPV是家蚕最常见的病原微生物之一，可导致家蚕罹患血液型脓病，给养蚕业带来巨大损失。家蚕血液型脓病的大面积爆发往往由少数患病个体造成，而病毒多角体的释放是BmNPV在群体内传播的关键环节。体外试验显示，灵菌红素在安全浓度范围内对BmNPV有独特的抑制作用:低浓度(10 nmol/L)时可抑制多角体形成，保护感染细胞不被裂解;高浓度(300-600 nmol/L)时可快速杀死感染细胞。尽管细胞存活率差异巨大，试验显示灵菌红素可有效抑制BmNPV多角体的形成。灵菌红素浓度为300 nmol。时，在12h内即可杀死超过70％的感染细胞，24 h后导致90％左右的感染细胞死亡。体内试验显示，健康家蚕平均每只经口添饲10 mg灵菌红素时不表现出明显的急性毒性，但可导致血液型脓病病蚕提前约48 h死亡，死亡个体中仅有17.59％±7.46％可在血淋巴中检测到多角体。据文献报道，灵菌红素可作用于DNA或DNA拓扑异构酶。本研究发现灵菌红素主要分布于细胞质中，因而无法与DNA或DNA拓扑异构酶发生直接作用。随后，我们进一步探讨了灵菌红素可能的作用靶标。分析发现caspase3抑制剂Ac-DEVD-CHO对感染细胞无影响，而caspase广谱性抑制剂Z-VAD-FMK可显著抑制多角体形成，暗示BmNPV增殖可能依赖上游caspase的活化。由于caspase可参与调控NF-κB信号通路，而报道显示NF-κB是灵菌红素的作用靶标之一，试验采用NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082处理感染细胞，发现多角体形成受到抑制，暗示BmNPV的增殖可能依赖NF-κB的活化。
　　试验表明，家蚕病原粘质沙雷氏菌的灵菌红素prodigiosin(CAS No.82-89-3)具有抗BmNPV的作用，同时也是首次发现灵菌红素prodigiosin具有抗病毒活性，其作用机制与生产应用值得进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 微生物及其产生的色素

1．1．1 产色素的微生物

1．1．2 微生物色素的应用

1．1．3 微生物色素的生理学功能

1．2 粘质沙雷氏菌与灵菌红素

1．2．1 粘质沙雷氏菌的发现

1．2．2 沙雷氏菌的分类及分布

1．2．3 灵菌红素的种类

1．2．4 粘质沙雷氏菌灵菌红素的合成途径

1．3 灵菌红素的生物学活性

1．3．1 灵菌红素的抗癌活性

1．3．2 灵菌红素的免疫抑制活性

1．3．3 灵茵红素的抗疟疾活性

1．3．4 灵茵红素的抗菌及抗其它原虫的活性

1．3．5 灵菌红素的其他应用

1．4 杆状病毒的侵染、传播与防控措施

1．4．1 杆状病毒简介

1．4．2 杆状病毒的侵染策略及方式

1．4．3 杆状病毒复制与昆虫细胞内抗病毒机制

1．4．4 杆状病毒的传播

1．4．5 家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的防控措施

第二章 引言

2．1 研究意义

2．2 研究内容

2．3 研究路线

第三章 粘质沙雷氏菌的分离、鉴定与发酵

3．1 材料和方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要仪器、试剂及溶液的配置

3．1．3 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 家蚕灵菌败血症病原菌的分离

3．2．2 家蚕灵菌败血症病原菌的鉴定及系统发育分析

3．2．3 粘质沙雷氏菌SCQ1菌株发酵条件的优化

3．2．4 以蚕蛹为主要碳、氮源的发酵培养基优化

3．3 讨论

第四章 灵菌红素的分离、纯化与检测

4．1 材料和方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 主要仪器、试剂及溶液的配置

4．1．3 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 灵菌红素的萃取与纯化

4．2．2 灵菌红素的检测

4．3 讨论

第五章 粘质沙雷氏菌灵菌红素的生理学功能

5．1 材料和方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 主要仪器、试剂及溶液的配置

5．1．3 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 灵菌红素与金属离子的显色反应

5．2．2 灵菌红素的荧光效应

5．2．3 粘质沙雷氏菌对金属离子的耐受性

5．2．4 粘质沙雷氏菌的菌落显微结构

5．2．5 粘质沙雷氏菌灵菌红素的分泌方式

5．2．6 灵菌红素对粘质沙雷氏菌生长的影响

5．2．7 粘质沙雷氏菌利用灵菌红素络合并传递金属离子

5．3 讨论

第六章 粘质沙雷氏菌灵菌红素的抗菌与抗癌活性

6．1 材料和方法

6．1．1 试验材料

6．1．2 主要仪器、试剂及溶液的配置

6．1．3 试验方法

6．2 结果与分析

6．2．1 灵菌红素对多种人体肠道病原细菌无显著抑制作用

6．2．2 灵菌红素对多种人体病原真菌无显著抑制作用

6．2．3 灵菌红素对多株人体癌细胞系具有选择性细胞毒性

6．2．4 灵菌红素诱导癌细胞凋亡

6．3 讨论

第七章 粘质沙雷氏菌灵菌红素抗BmNPV的活性

7．1 材料和方法

7．1．1 试验材料

7．1．2 主要仪器、试剂及溶液的配置

7．1．3 试验方法

7．2 结果与分析

7．2．1 灵菌红素对家蚕BmN细胞系安全浓度的筛选

7．2．2 BmNPV病毒滴度测定

7．2．3 灵菌红素的抗病毒作用

7．2．4 灵菌红素抑制BmNPV病毒多角体形成

7．2．5 灵菌红素抗BmNPV病毒的时间效应

7．2．6 灵菌红素作用靶标的分析与探讨

7．2．7 利用灵菌红素选择性的清除BmNPV病蚕

7．3 讨论

第八章 综合与结论

论文创新点

参考文献

附录

在读期间发表的论文及参加的课题

致谢