MSH1 RNAi干扰载体的构建及转基因芥菜的获得

摘要

作物杂种优势的利用途径主要有自交不亲和以及雄性不育两种途径。由于利用自交不亲和系生产杂交种时，存在自交不亲和系多代自交后容易出现衰退且繁殖需要人工蕾期授粉，生产成本高，杂交种纯度难以达到100％等问题。因此，选用雄性不育系进行杂交制种受到广泛青睐。芥菜是十字花科重要的蔬菜作物，但芥菜是高度自交亲和性的作物，所以芥菜雄性不育系的选育对生产芥菜杂交种有重要的意义。
　　随着现代生物技术的快速发展，利用基因工程获得雄性不育已经成为植物雄性不育研究热点之一，其中细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）机理的研究更是得到国内外学者的普遍关注。一个已经被大家认可的观点是:细胞质雄性不育的基因来自于线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。但目前尚无直接证据证明叶绿体基因组的变异导致CMS，所以目前研究者们普遍认为是线粒体基因组的变异导致了CMS。而研究表明，细胞核中维持线粒体基因组稳定性的基因主要有MSH1、RECA3、以及OSB1，一旦这些基因的功能受到抑制或者破坏，线粒体基因组会发生重排，进而导致植株表型的变化，甚至是产生细胞质雄性不育。在维持线粒体基因组稳定性的MSH1、RECA3、以及OSB1三个基因中，MSH1的作用最为关键。目前，国内针对该基因的功能研究尚未开始，在十字花科作物芥菜上的研究也更是没有。已有研究显示，MSH1不仅与CMS有关，也与植株其它的表型变化相关，例如开花延迟、叶绿素含量增加。因此本实验以“渝丰”榨菜为材料，研究MSH1基因RNAi干扰表达对芥菜植株的表型变化的影响，在此基础上希望通过转基因手段获得非转基因的细胞质雄性不育芥菜，开花延迟的芥菜，光合能力提高的芥菜资源。本实验主要获得结果如下:
　　1、从甘蓝的cDNA中克隆得到687bp大小的MSH1目标干扰片段，与从甘蓝测序数据库中拼接的甘蓝MSH1序列进行比较，序列相似度达到98％。该序列与从芥菜基因组克隆得到MSH1相应片段序列相比较，两者同源性高达的95％。以该片段为基础，构建了以Bar基因为除草剂PPT筛选标记基因的RNAi干扰植物表达载体pCA13BarMSH1RNAi。
　　2、利用农杆菌介导法，将pCA13BarMSH1RNAi表达载体转入芥菜植株，获得了7株抗除草剂PPT的转基因芥菜植株。
　　3、获得的7株T0代转基因芥菜中，无雄性不育现象被观察到，但发现部分植株表现植株分枝增加，植株矮小。其中m-2、m-3、m-5、m-7这4株的分枝增加;m-6植株矮小;而m-1、m-4的表型正常。
　　4、7株T0代转基因植株均自交获得T1代，T1代苗期无异常表型出现。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物雄性不育研究情况

1．1．1 植物雄性不育

1．1．2 细胞质雄性不育

1．2 植物线粒体基因组的特点

1．3 线粒体基因表达与细胞质雄性不育

1．4 核基因组中与线粒体基因组稳定性相关的基因

1．4．1 MSH1基因

1．4．2 RECA3基因

1．4．3 OSB1基因

1．5 核基因表达调控的线粒体重组与植株表型变化

1．5．1 MSH1基因表达调控的线粒体重组与表型变化

1．5．2 msh1 recA3双重突变体对线粒体重组与植株表型的影响

1．6 RNAi及反义RNA的研究与应用

1．6．1 RNAi的定义

1．6．2 RNAi的作用机制

1．6．3 RNAi的特点

1．6．4 反义RNA

1．6．5 RNAi及反义RNA在植物中的应用

第二章 引言

2．1 研究的目的与意义

2．2 研究内容

2．3 研究的技术路线

第三章 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要溶液与培养基

3．1．3 主要生化试剂

3．1．4 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 甘蓝叶片RNA提取以及逆转录

3．2．2 甘蓝cDNA中MSH1基因的克隆及序列分析

3．2．3 芥菜MSH1基因序列与甘蓝MSH1基因序列的同源性比较

3．2．4 植物表达载体的构建

3．2．5 质粒转化农杆菌

3．2．6 农杆菌介导法转化芥菜

3．2．7 获得的转基因芥菜PCR检测

3．2．8 转基因芥菜的表型分析

3．2．9 转基因芥菜T1代分析

第四章 结果与分析

4．1 拟南芥、白菜、甘蓝MSH1基因序列的同源性比较

4．2 甘蓝MSH1基因RNAi干扰片段的获得

4．3 芥菜MSH1和甘蓝MSH1同源性分析

4．4 植物表达载体pCA13BarMSH1RNAi的构建及检测

4．4．1 MSH1 RNAi干扰植物表达载体pCA13BarMSH1RNAi的构建

4．4．2 pCA13BarMSH1RNAi载体检测

4．5 转基因芥菜的获得

4．5．1 农杆菌介导法获得转基因芥菜植株

4．5．2 抗除草剂芥菜的PCR检测

4．6 T0代转基因芥菜的表型观察

4．7 转基因芥菜T1代幼苗的PPT筛选和PCR检测

第五章 讨论

第六章 结论

6．1 MSH1基因序列在不同十字花科蔬菜中高度保守

6．2 利用甘蓝的MSH1基因片段构建了干扰载体

6．3 干扰载体pCA13BarMSH1RNAi被转入芥菜获得相应的转基因植株

参考文献

致谢

附录

附录1 缩写词

附录2 人工拼接甘蓝的MSH1全长

附录3 从甘蓝cDNA中克隆得到的MSH1序列

附录4 在学期间发表文章