甘薯GGDS基因克隆及功能分析

摘要

甘薯在发展中国家最重要的粮食作物中排名第五，仅次于水稻，小麦，玉米和木薯。很多研究表明甘薯是最健康的食物，因为其富含多种复杂的碳水化合物，抗氧化的花色素苷和多种类胡萝卜素等。甘薯薯块的颜色有白色，黄色，紫色和橘色等，但是只有橘色品种的甘薯才含有丰富的维他命A的前体物质β-胡萝卜素。事实上，橘色品种的甘薯在非洲和东南亚的不发达国家是人们获得β-胡萝卜素的主要来源。然而，甘薯中的β-胡萝卜素含量远远低于人类生理活动的正常需求，这将会导致一系列的维他命A缺乏症，比如干眼症，角膜病变，角膜软化，有的甚至导致死亡。所以提高甘薯中β-胡萝卜素的含量有着重要意义。
　　基于甘薯中类胡萝卜素生物合成途径的分子和生物化学水平通过基因工程手段改造β-胡萝卜素代谢途径来提高甘薯中β-胡萝卜素含量是可行的方法之一。类胡萝卜素合成机制在果实和花中已经被普遍研究，但是很少在地下根组织中研究。20碳的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸是一种一系列物质的普遍前体，这些物质包括:β-胡萝卜素，叶绿素，植物激素（ABA和GA），叶绿醌，生育酚等。牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGDS)催化异戊二烯二磷酸和二甲基丙烯基二磷酸合成牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGDP)。
　　本研究从甘薯中克隆得到了类胡萝卜素合成途径中的一个异戊烯基转移酶基因(IbGGDS，GenBank登录号:KF991091)，并对其进行生物信息学分析，结果表明，该基因cDNA全长1409bp，其中包含了一个1092bp的开放阅读框，编码一个含363个氨基酸残基的多肽。通过氨基酸序列多重比对发现该基因的氨基酸序列和预测的蛋白结构和已经报道的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGDS)和牻牛儿基二磷酸合成酶(GPPS)的一个大亚基高度相似。IbGGDS的N端有一个63个氨基酸的质体转运肽。将核心编码区的1092bp核苷酸序列以及编码质体转运肽的189bp核苷酸序列构建亚细胞定位载体，转化烟草的原生质体。在激光共聚焦显微镜下观察到IbGGDS蛋白及其质体转运肽确实使GFP转运到叶绿体。IbGGDS的质体定位证明了该基因编码蛋白质定位于合成β-胡萝卜素的场所-质体。用切去质体转运肽的IbGGDS在大肠杆菌中重建β-胡萝卜素代谢途径，含有IbGGDS的工程菌因为生产类胡萝卜素而变成黄色。这就证明了乃GGDS编码的酶具有合成牻牛儿基牻牛儿基二磷酸的功能。
　　最后，本研究采用qPCR的方法对IbGGDS和其下游五个β-胡萝卜素合成途径基因包括PSY、 PDS、ZDS、crtlSO和LYCB在橘黄色薯块的甘薯块根、须根、成熟叶片、幼嫩叶片、成熟茎、幼嫩茎、成熟叶柄这七个组织的相对表达量分析，就IbGGDS来说，在块根中的相对表达量分别比须根、成熟茎、成熟叶柄、成熟叶、幼嫩叶和幼嫩茎高18、25、18、4、5和14倍。PSY是β-胡萝卜素途径上的第一个关键酶，LYCB是β-胡萝卜素途径上的最后一个关键酶。PSY在块根中的相对表达量分别比须根、成熟茎、成熟叶柄、成熟叶片、幼嫩叶片和幼嫩茎高618、898、93、88、22和648倍，LYCB在块根中的相对表达量分别比须根、成熟茎、成熟叶柄、成熟叶片、幼嫩叶片和幼嫩茎高167、45、42、15、8和49倍。结果表明lbGGDS、PSY、 PDS、ZDS、crtlSO和LYCB都是在块根中特异表达，基因表达分析结果表明甘薯地下块根是β-胡萝卜素生物合成的主要器官。
　　通过HPLC的方法对相应组织的β-胡萝卜素含量进行分析发现，成熟叶片中的β-胡萝卜素含量为1.72±0.059 mg/g FW，幼嫩叶片中β-胡萝卜素含量为1.13±0.034 mg/g FW，分别比块根中的含量(0.19±0.020 mg/g FW)高了9.11倍和5.98倍。须根中检测到少量的β-胡萝卜素（0.06±0.002 mg/g FW），成熟叶柄和成熟茎中只能检测到微量的β-胡萝卜素(分别为0.015±0.002 mg/g FW和0.008±0.001mg/g FW)。有意思的是，成熟叶片和幼嫩叶片中β-胡萝卜素含量远远高于块根，甘薯叶片是β-胡萝卜素的主要储存器官。本研究推测β-胡萝卜素在甘薯的块根中合成后通过某种转运机制运输到叶片中储存。
　　本研究证实了克隆得到的IbGGDS的确是β-胡萝卜素合成途径中的GGDS基因，对甘薯GGDS基因的研究对利用基因工程手段调节甘薯类胡萝卜素合成途径有重要意义。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 文献综述

1．1 背景概况

1．2 甘薯的生产现状与开发应用前景

1．2．1 甘薯的生产应用现状

1．2．2 甘薯的营养价值

1．2．3 甘著的开发应用前景

1．3 β-胡萝卜的保健功能及其生物合成途径

1．3．1 β-胡萝卜素与其生理保健功能

1．3．2 β-胡萝卜素生物合成途径

1．4 β-胡萝卜素生物合成途径中部分关键酶基因

1．4．1 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGDS)

1．4．2 八氢番茄红素合成酶(PSY)

1．4．3 八氢番茄红素脱饱和酶(PDS)和ζ-胡萝卜素脱饱和酶(ZDS)

1．4．4 类胡萝卜素异构酶(crtISO)

1．4．5 番茄红素环化酶(LYCB)

1．5 在大肠杆菌中重建类胡萝卜素代谢途径

第2章 绪论

2．1 研究目的和意义

2．2 研究范围和内容

2．3 技术路线

第3章 材料与方法

3．1 植物材料

3．2 菌株和质粒

3．3 仪器和设备

3．4 试剂盒及试剂

3．5 常规方法介绍

3．5．1 RNA的提取

3．5．2 DNA产物的琼脂糖凝胶电泳

3．5．3 目的条带的回收

3．5．4 目的片段与克隆载体T连接

3．5．5 大肠杆菌DH5α和XL1-Blue感受态细胞的制备(CaCl2法)

3．5．6 连接反应物转化大肠杆菌感受态细胞

3．6 IbGGDS基因cDNA的克隆与分析

3．6．1 从甘薯总RNA合成第一链cDNA

3．6．2 目的基因的克隆

3．6．3 IbGGDS基因的生物信息学分析

3．7 IbGGDS蛋白的亚细胞定位

3．7．1 亚细胞定位载体构建

3．7．2 烟草叶肉细胞原生质体的制备

3．7．3 原生质体的转化及激光共聚焦显微镜观察

3．8 IbGGDS颜色互补功能验证

3．8．1 颜色互补功能验证载体构建

3．8．2 颜色互补功能验证载体工程菌的获得

3．8．3 HPLC检测工程菌中β-胡萝卜素含量

3．9 甘薯各组织IbGGDS及相关基因的相对表达量检测

3．10 甘薯各组织中β-胡萝卜素含量的检测

第4章 结果与分析

4．1 IbGGDS基因cDNA的获得和生物信息学分析

4．1．1 IbGGDS基因的获得

4．1．2 IbGGDS基因的生物信息学分析

4．1．3 IbGGDS与植物异戊烯基转移酶氨基酸序列的多重比对

4．1．4 IbGGDS分子进化树的构建

4．1．5 IbGGDS蛋白的保守结构域分析

4．1．6 IbGGDS蛋白亲／疏水性预测

4．1．7 IbGGDS蛋白二级结构预测

4．1．8 IbGGDS蛋白三级结构预测

4．2 IbGGDS蛋白及其质体转运肽的亚细胞定位结果分析

4．2．1 亚细胞定位载体构建结果

4．2．2 亚细胞定位结果分析

4．3 IbGGDS颜色互补功能验证结果分析

4．3．1 颜色互补功能验证载体构建

4．3．2 携带不同质粒的XL1-Blue生长情况比较

4．3．3 工程菌中β-胡萝卜素含量的检测结果分析

4．4 甘薯各组织IbGGDS及相关基因的相对表达量检测结果分析

4．4．1 qPCR引物的特异性分析

4．4．2 qPCR检测结果分析

4．5 甘薯各组织中β-胡萝卜素含量的检测

4．5．1 高效液相色谱法HPLC检测标准的建立

4．5．2 HPLC检测结果分析

第5章 结论

参考文献

附录

缩略词表

硕士期间发表论文

致谢