热应激对肉牛生理生化指标及外周血microRNA表达水平的影响

摘要

热应激是影响动物生长和生产效率的重要因素之一，研究动物热应激反应机制具有重要的理论意义和实用价值。研究发现microRNAs(miRNA)参与了机体多种生物学过程的调节，随着高通量测序技术在miRNA研究中的广泛应用，小RNA测序(miRNA-seq)技术可挖掘动物不同热应激下功能相关的miRNAs。通过比较不同生物学过程中差异表达的miRNAs，可以为解释热应激下动物生理变化提供依据，并发掘与热应激调控相关的miRNAs。
　　本试验于重庆市良种肉牛场选取5头体况良好、年龄体重且相同饲养管理的红安格斯母牛作为研究对象，分别在热应激和非热应激下测定牛直肠温度和呼吸频率，并用真空采血针于颈静脉采集牛外周血为试验材料。测定了热应激和非热应激下牛血清生化指标、抗氧化指标以及免疫相关指标。同时构建了2个小RNA文库即热应激HH和非热应激HC，采用Solexa测序方法筛选出2文库中各类型的miRNAs。对2个文库的miRNAs表达谱分析，筛选出差异表达的miRNAs。利用靶基因预测软件Targetscan，预测了差异表达miRNAs调控的靶基因，并通过GO和Pathway分析预测了这些靶基因参与的生理过程，从而解释差异表达miRNAs在不同热应激环境下的功能差异。
　　生理生化指标分析发现，热应激下牛直肠温度和呼吸频率极显著高于非热应激（P＜0.05）;血清中阳离子K+、Na+和Ca+浓度低于非热应激（P＞0.05），阴离子Cl-浓度显著低于非热应激(P＜0.05)，表明热应激下牛机体内环境失衡;热应激下总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低(P＜0.05)，过氧化物歧化酶(SOD)活性极显著低于非热应激(P＜0.01)，丙二醛(MDA)显著高于非热应激(P＜0.05)，表明热应激下牛抗氧化能力下降;血清中IgA和IgG含量显著降低(P＜0.05)，IgM含量低于非热应激(P＞0.05)，IL-2、IL-6和IL-10含量降低，IL-4和IL-8含量高于非热应激，表明热应激下牛免疫功能下降。
　　2个小RNA文库Solexa测序共获得191万条序列种类以及2，534万条总拷贝数。剔除冗杂序列，非miRNA等序列后，获得73万条clean reads，对应总的序列拷贝数1，959万条，并且reads长度满足Dicer酶切割特征。
　　将获得的clean reads与各数据库进行比对，共挖掘1011个miRNAs，其中牛中已知的miRNAs546个，种间保守的miRNAs168个以及新预测了297个miRNAs;试验发现267个pre-miRNAs的5'和3'共表达，说明miRNAs的调节具有复杂性。对构建的表达谱分析发现，2个文库中832个miRNAs共表达，HH和HC文库中分别有89和90个miRNAs特异表达;2文库中拷贝数在3-100的miRNAs平均占总数量的64.78％，而排名前20miRNAs的拷贝数平均占总拷贝数的70.63％，表明文库中少量miRNAs高表达。
　　分析热应激和非热应激下2个文库中miRNAs差异表达发现，315个miRNAs存在差异表达（P＜0.01），其中热应激下118个miRNAs表达上调，197个miRNAs表达下调。筛选出热应激下表达上调和下调前10位的miRNAs进行靶基因预测和GO及Pathway分析，结果显示，在热应激下表达上调的miRNAs调控的基因主要参与细胞凋亡、增殖和蛋白激酶级联反应，在热应激下表达下调的miRNAs主要参与免疫功能的调节。
　　通过本试验的研究，不仅揭示了热应激对牛生理生化指标的影响，新发现了牛外周血中表达的候选miRNAs，还从miRNAs的角度初步分析了热应激和非热应激下牛机体生物学调控差异，为肉牛的抗热应激选育提供依据。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 文献综述

1．1 热应激研究进展

1．1．1 热应激概念

1．1．2 热应激的评判指标

1．2 热应激对家畜的影响

1．2．1 热应激对家畜体温和呼吸机能的影响

1．2．2 热应激对家畜生长性能的影响

1．2．3 热应激对家畜繁殖性能的影响

1．2．4 热应激对瘤胃内环境指标的影响

1．3 热应激条件下血液的生化指标差异

1．3．1 热应激条件下血液电解质平衡的变化

1．3．2 热应激条件下血清激素水平及酶类含量

1．4 microRNA及其生物学功能

1．4．1 microRNA简述

1．4．2 microRNA的形成及调控机制

1．4．3 microRNA的研究方法

1．4．4 miRNA对生物机体的调控

1．4．5 热应激对microRNA表达的影响

第2章 热应激对牛生理及血液生化指标的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 试验动物

2．1．2 试剂和仪器

2．1．3 试验设计

2．1．4 牛舍环境温湿度记录

2．1．5 牛直肠温度与呼吸频率的测定

2．1．6 血清制备与指标测定

2．2 数据统计与分析

2．3 结果与分析

2．3．1 牛舍THI的测定

2．3．2 热应激下牛生理指标的测定

2．3．3 热应激对牛血清生化指标的影响

2．4 讨论

2．4．1 试验期间THI、牛直肠温度和呼吸频率的变化

2．4．2 热应激对血清中离子含量的影响

2．4．3 热应激对血清酶及内分泌指标的影响

2．4．4 热应激对牛抗氧化能力的影响

2．4．5 热应激对牛免疫功能的影响

2．5 小结

第3章 不同条件下牛外周血miRNA文库构建及高通量测序

3．1 材料与方法

3．1．1 试验动物

3．1．2 仪器和试剂

3．1．3 分析程序和数据库

3．1．3 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 琼脂糖凝胶电泳结果分析

3．2．2 毛细管电泳质检结果

3．2．3 测序结果的初步筛选

3．2．4 文库小RNA的注释

3．2．5 Clean reads序列的长度分布统计

3．3 讨论

3．3．1 试验样本的选择

3．3．2 miRNA测序方法的选择

3．3．3 牛外周血small RNA文库测序质量分析

3．4 小结

第4章 不同热应激环境下牛miRNA表达谱特征分析

4．1 材料与方法

4．1．1 数据库

4．1．2 miRNA的检出和命名

4．2 结果与分析

4．2．1 miRNA检出统计

4．2．2 两文库中的miRNAs的表达分布

4．2．3 miRNAs的共表达

4．3 讨论

4．3．1 高通量测序技术下牛完整miRNAs的挖掘

4．3．2 pre-miRNA的表达研究

4．3．3 牛外周血文库中miRNAs的表达谱分析

4．4 小结

第5章 不同文库中差异表达的miRNAs及其生物信息学分析

5．1 材料与方法

5．1．1 miRNAs差异表达分析

5．1．2 差异表达miRNAs的靶基因预测

5．1．3 miRNA靶基因的功能注释

5．1．4 miRNA靶基因KEGG通路分析

5．2 结果与分析

5．2．1 热应激下表达上调和下调的miRNAs

5．2．2 热应激下差异表达miRNA的靶基因预测

5．2．3 GO和Pathway term分类结果

5．3 讨论

5．3．1 热应激下高表达miRNAs的生物学功能分析

5．3．2 热应激下表达下调的miRNAs生物学功能分析

5．4 小结

第6章 全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表文章及参加课题