RNA干扰技术研究五氯酚PCP对MCF-7细胞类固醇激素相关基因表达的影响

摘要

氯酚类化合物是一类由于不合理使用而普遍存在的环境污染物，在所有的氯酚类化合物中，五氯酚(PCP)较多地用于控制白蚁和保护木材。这些氯酚类化合物（尤其是PCP）高剂量的急性暴露具有致命的作用。PCP是稳定持续地存在于环境中，如空气、水和土壤中;此外还可以通过摄食、皮肤的吸收进入到身体，从而增加了人类和啮齿动物患癌的风险。在哺乳动物和人类中，由PCP引发的毒性机制在体内外中均有研究报道。PCP可能提高啮齿动物致癌的风险，人类的恶性淋巴瘤和白血病的发生可能也与职业暴露PCP有关联，并且PCP还具有内分泌干扰物的活性，它可以影响鲫鱼血清睾酮水平的表达。此外，有报道指出，高剂量的PCP可能造成生物体体温升高、肝脏缺陷、免疫系统的损伤以及破坏正常性别、认知、生理和情感的发育。目前关于PCP的毒性和它潜在的致癌性，国内外学者已经进行了相关的研究，但是PCP对生物体的内分泌干扰机制研究的很少，并且具体的分子机制问题也一直不清楚。因此，本课题主要选用人乳腺癌细胞MCF-7(即阳性表达雌激素受体ERα)和人骨肉瘤细胞U2-OS作为离体研究对象，研究PCP暴露对离体细胞MCF-7和U2-OS增殖效应的影响，PCP暴露对MCF-7和U2-OS两种细胞内类固醇激素合成酶关键基因表达的影响;此外，结合RNA干扰和质粒转染等技术，研究在MCF-7细胞中将ERα基因干扰后，PCP对MCF-7细胞中类固醇激素合成酶关键基因的影响，从而探索PCP是通过受体(ERα)还是非受体途径行使内分泌干扰作用，以期从细胞、分子水平上研究并揭示PCP对生物体行使内分泌干扰作用的机制。研究内容主要包括以下部分:
　　1.研究PCP对MCF-7和U2-OS细胞的毒性作用，并确定PCP对这两种细胞作用48h后的半致死率浓度。本研究先将MCF-7和U2-OS细胞暴露在不同浓度的PCP培养基中，以200μmol·L-1作为PCP最高作用浓度，稀释因子为2，依次选取8个PCP作用浓度，作用24h和48h后，运用MTT法检测PCP对这两种细胞的增殖作用，并分析PCP作用两种细胞48h的半致死率浓度。研究结果发现，PCP可以抑制MCF-7和U2-OS细胞的生长，并且具有一定的浓度效应;PCP作用MCF-7和U2-OS两种细胞48h的半致死率浓度分别为97.08μmol·L-1和90.23μmol·L-1。
　　2.检测PCP对MCF-7和U2-OS细胞中类固醇激素合成酶关键基因表达的影响，从而初步揭示PCP对生物体内分泌干扰的作用机制。根据PCP对两种细胞的毒性作用结果，选用6.25μmol·L-1、12.5μmol·L-1、25μ mol·L-1和50μmol·L-1四个浓度的PCP对MCF-7细胞和U2-OS细胞作用48h，然后运用Real-time PCR检测MCF-7及U2-OS细胞中类固醇激素合成酶关键基因(CYP17、CYP19、StAR和17β-HSD12)mRNA表达的影响。研究结果发现，不同浓度的PCP均能抑制MCF-7细胞和U2-OS细胞中CYP17、StAR和17β-HSD12基因的表达，初步说明PCP可以改变类固醇激素合成酶关键基因的表达。有研究报道，PCP可以通过改变类固醇激素合成酶的表达改变机体产生激素的绝对和相对浓度及其比率，从而发挥干扰生物体内分泌的作用。而CYP19基因在两种细胞中的表达存在差异，在MCF-7细胞中，CYP19基因的表达先下降后上升;在U2-OS细胞中CYP19基因的表达呈现出上升效应，说明PCP对CYP19基因的影响可能存在组织和细胞的表达差异。
　　3.为了进一步揭示PCP是通过与受体相互作用还是非受体即影响细胞内类固醇激素合成酶关键基因的表达而干扰内分泌系统的作用。本研究采用RNAi技术，对MCF-7细胞内ERα基因进行干扰质粒的转染。设计4条ERα基因干扰序列并构建到pGPU6/GFP/Neo质粒上，且设计ERα基因的阴性干扰序列作为对照，通过测序鉴定，5条干扰序列成功构建到pGPU6/GFP/Neo载体上。将构建好的5条干扰质粒分别转染到MCF-7细胞中，通过G418培养基对转染细胞进行筛选，将筛选出的阳性细胞进行鉴定。通过Real-time PCR和western blott对ERα在mRNA和蛋白水平进行干扰效率鉴定，然后确定干扰效率最佳的细胞株。
　　4.利用Real-time PCR检测不同浓度6.25μmol·L-1、12.5μmol·L-1、25μmol·L-1和50μmol· L-1的PCP对ERα基因干扰后的MCF-7细胞中类固醇激素合成酶关键基因（CYP17、CYP19、StAR和17β-HSD12）的表达。研究结果发现，在低浓度PCP作用时，可以抑制CYP17和StAR mRNA的表达，但在高浓度PCP作用时，可以诱导CYP17和StAR mRNA表达。在6.25μmol·L-1和50μmol·L-1 PCP作用时，CYP19 mRNA被诱导;在12.5μmol·L-1 PCP作用时，CYP19mRNA的表达却受到了抑制。通过对比ERα基因干扰前后，MCF-7细胞中类固醇激素合成酶关键基因的变化，初步得出结论，低浓度的PCP可能通过其他信号通路改变了类固醇激素合成酶基因的表达，造成内分泌系统的紊乱;高浓度的PCP可能一部分会直接与ERα相互作用引起内分泌系统的紊乱。通过以上研究从细胞、分子水平上揭示PCP对生物体内分泌干扰的作用机制。

目录

声明

缩写与符号

摘要

第1章 文献综述

1．1 五氯酚的污染现状

1．2 五氯酚对生物体的毒性研究

1．3 五氯酚干扰内分泌系统的研究

1．3．1 受体介导反应

1．3．2 非受体介导反应

1．3．3 影响内分泌系统、神经系统与免疫系统的综合效应

1．4 RNA干扰技术的简介

1．4．1 RNAi的作用机制与特点

1．4．2 RNAi的应用

1．5 类固醇合成酶关键基因的功能研究

1．5．1 CYP17

1．5．2 CYP19

1．5．3 StAR

1．5．4 17β-HSD

第2章 绪论

2．1 选题的背景及意义

2．2 研究目的和主要研究内容

2．2．1 研究目的

2．2．2 研究内容

2．3 创新之处

2．4 技术路线

第3章 五氯酚对MCF-7和U2-OS细胞中类固醇激素合成酶关键基因的影响

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．3．1 细胞培养

3．3．2 细胞冻存

3．3．3 MTT法检测MCF-7和U2-OS细胞的抑制作用

3．3．4 细胞总RNA的提取

3．3．5 cDNA样品的制备

3．3．6 荧光定量RCR的引物的设计合成与检测

3．3．7 Real-time PCR

3．3．8 数据统计分析

3．4 实验结果

3．4．1 MTT法检测MCF-7和U2-OS细胞抑制的结果

3．4．2 细胞总RNA提取结果

3．4．3 PCP对MCF-7细胞中类固醇激素合成酶关键基因表达的影响

3．4．4 PCP对U2-OS细胞中类固醇激素合成酶关键基因表达的影响

3．5 讨论

3．6 结论

第4章 PCP对ERα基因干扰后的MCF-7细胞中类固醇激素合成酶关键基因的影响

4．1 前言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．3．1 ERα RNA干扰质粒载体的构建

4．3．2 G418筛选稳定表达的MCF-7细胞系

4．3．3 质粒的转染

4．3．4 Real-time PCR检测职ERα mRNA的表达

4．3．5 western blot印迹法检测RNAi后ERα蛋白的表达

4．3．6 Real-time PCR检测PCP对MCF-7细胞中ERα干扰后类固醇激素合成酶关键基因表达的影响

4．3．7 数据统计分析

4．4 实验结果

4．4．1 Real-time PCR检测干扰质粒对MCF-7细胞中ERα mRNA表达的影响

4．4．2 western blot免疫印迹法检测干扰质粒对MCF-7细胞中ERα蛋白表达的影响

4．4．3 PCP对MCF-7细胞中ERα干扰后类固醇激素合成酶关键基因表达的影响

4．5 讨论

第5章 全文总结和展望

5．1 全文总结

5．2 展望

参考文献

致谢

附录