山东和陕西苹果病毒病病原鉴定及多重RT-PCR检测体系的建立

摘要

本研究于2012年4月和7月先后从山东和陕西分别采集了54份和50份苹果叶片样品。从文献中筛选了苹果花叶病毒(Apple mosaic virus，ApMV)，苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)，苹果绿皱果病毒(Apple green crinklevirus，AGrCV)，苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)，苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)和苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spotvirus，ACLSV)等5种苹果病毒类病原物的特异性引物，对山东和陕西部分随机挑选的样品进行检测，结果显示，除ApMV检测呈阴性外，从部分样品中均检测到其余4种病原的特异性条带，将扩增得到的基因片段进行克隆测序和序列分析，明确了样品受到ASSVd、ASPV、ACLSV和ASGV的侵染。根据RT-PCR检测结果和测得的基因序列，结合GenBank中已报道的相关病毒的基因序列，设计扩增这4种病毒类病原物的特异性引物，经过筛选，并经扩增体系和扩增条件的优化，最终建立了同时扩增ASSVd、ASPV、ACLSV和ASGV的多重RT-PCR体系。对该检测体系进行了特异性和灵敏性测试，结果表明，多重RT-PCR扩增的特异性强，能同时检测出4种病毒类病原物的最低检出限为10-2 ng级。利用该多重RT-PCR选取了100份采自山东和陕西苹果叶片样品进行了检测，检测情况表明，在青岛、烟台、渭南和咸阳4个地区的样品中均检测出4种病毒类病原，其中山东地区优势病毒种为ASPV，青岛和烟台的检出率分别为88.9％和84.4％，而陕西地区的优势种为ASGV和ASPV，渭南和咸阳ASGV检出率分别是81.0％和79.3％，ASPV检测率也分别是81.0％和79.3％。ACLSV在4个地区样品中的检测率相对较低。4个地区所采集的样品中病毒复合侵染现象严重，其中青岛、烟台、渭南和咸阳样品中复合侵染率分别为66.7％，75.0％，85.7％和89.7％。青岛、烟台、渭南和咸阳的最主要的复合侵染类型分别为ACLSV+ASPV+ASSVd、ASGV+ASPV、ASGV+ASPV+ASSVd和ASGV+ASPV+ASSVd。
　　为研究ACLSV病毒的变异情况，将ACLSV全长序列分为6段进行扩增，分别得到了2435 bp、1435 bp、861 bp、1605 bp、1095 bp和749 bp的基因片段，经过测序分析，确认基因序列正确，经DNAStar SeqMan进行拼接得到ACLSV基因组7557 bp全长序列（登录号KJ522693）。该全基因组包含3个开放阅读框，分别编码RNA聚合酶、运动蛋白和外壳蛋白，5'UTR和3UTR分别有151 nt和195 nt的非编码区。经全基因组构建进化树分析，该ACLSV全序列与日本的苹果分离物B6序列(GenBank no.AB326224)核苷酸相似性最高，为85.9％。
　　本文研究了ASGV外壳蛋白基因(CP)的原核表达。将ASGV CP的克隆重组载体和表达载体pET-28a(+)用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ于37℃酶切反应过夜，纯化回收酶切产物，用T4 DNA连接酶4℃连接反应过夜，转化到大肠杆菌DH5α感受态中繁殖，经菌液酶切和PCR鉴定，挑选阳性克隆的菌液测序验证，测序结果表明，目的片段ASGV CP正确克隆到表达载体pET-28a(+)中，说明原核表达载体构建成功。提取已构建成功的原核表达载体pET-28a-ASGV-CP质粒，转化到表达菌株BL21(DE3) pLysS感受态细胞中，37℃培养至菌液OD值0.6～0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度1 mmol/L，继续于27℃培养3.5小时，将菌液离心、悬浮，加入2×上样缓冲液，煮沸10 min，冷却后进行SDS-PAGE电泳分析，电泳显示有33 kDa目标蛋白表达，结果表明融合蛋白在BL21(DE3) pLysS中已成功表达。用标签蛋白纯化回收试剂盒获得纯化的融合蛋白，为下一步的抗血清制备奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 苹果在我国的经济地位

1．2 苹果病毒病概况

1．2．1 地理分布

1．2．2 寄主范围

1．2．3 危害症状特点

1．2．4 传播途径

1．2．5 病毒基因组特性

1．3 苹果病毒病害的防治

1．4 苹果病毒检测方法研究进展

1．4．1 目测法

1．4．2 指示植物法

1．4．3 电子显微镜技术检测法

1．4．4 血清学方法

1．4．5 分子生物学技术

引言

第二章 山东和陕西苹果主要病毒种类的分子鉴定

2．1 试验材料

2．1．1 供试寄主植物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 常用实验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 样品总RNA的提取

2．2．2 反转录合成第一链cDNA

2．2．3 检测引物

2．2．4 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测

2．2．5 PCR产物纯化回收

2．2．6 T-载体连接

2．2．7 转化

2．2．8 序列测定与分析

2．2．9 ACLSV基因组全长扩增

2．3 结果与分析

2．3．1 提取样品总RNA琼脂糖凝胶电泳检测

2．3．2 RT-PCR扩增

2．3．3 测序结果与分析

2．3．4 ACLSV基因组全长分析

2．4 讨论

第三章 我国苹果主要病毒多重RT-PCR检测体系的建立

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 引物设计

3．1．3 单一RT-PCR

3．1．4 单一RT-PCR产物克隆和重组质粒的提取

3．1．5 多重RT-PCR

3．1．6 多重RT-PCR灵敏性测试

3．2 结果与分析

3．2．1 单一RT-PCR测序确认

3．2．2 多重RT-PCR优化

3．2．3 多重RT-PCR灵敏性测试

3．3 讨论

第四章 多重RT-PCR检测体系的应用

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂

4．1．2 田间样品

4．1．3 样品总RNA提取

4．1．4 反转录合成第一链cDNA

4．1．5 多重RT-PCR检测

4．1．6 单一RT-PCR检测

4．2 结果与分析

4．2．1 多重RT-PCR检测

4．2．2 病毒复合侵染

4．2．3 单一RT-PCR检测检验

4．3 讨论

第五章 ASGV CP基因原核表达载体构建及诱导表达

5．1 实验材料

5．1．1 CP基因来源及克隆所用质粒和菌株

5．1．2 主要试剂

5．1．3 引物设计

5．2 实验方法

5．2．1 ASGV CP全长基因的PCR扩增与克隆

5．2．2 表达载体和重组载体双酶切

5．2．3 原核表达载体的构建

5．2．4 CP基因在大肠杆菌中的诱导表达

5．2．5 SDS-PAGE分析

5．2．6 融合蛋白的大量表达及纯化回收

5．2．7 Bradford法测定纯化蛋白浓度

5．3 结果与分析

5．3．1 ASGV CP全长基因的扩增

5．3．2 pET-28a(+)和pGEM-ASGV-CP双酶切鉴定

5．3．3 pET-28a-ASGV-CP质粒的PCR鉴定

5．3．4 测序结果

5．3．5 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及纯化回收

5．3．6 纯化蛋白浓度测定

5．4 讨论

结论与展望

1 结论

1．1 建立了同时检测4种病毒类病原的多重RT-PCR检测体系

1．2 ACLSV基因组全长扩增

1．3 构建了苹果茎沟病毒外壳蛋白的原核表达载体

1．4 成功诱导了ASGV CP表达载体的融合表达并纯化回收到目标蛋白

2 展望

参考文献

附录A 本论文中所用病毒缩写及中英文对照

附录B 本论文中所用缩写词及中英文对照

附录C 常用生化及分子生物学试剂与仪器

附录D 常用试剂的配制

致谢

在学期间发表和已录用论文及参加课题