桔小实蝇胰岛素信号通路六个重要基因的表达与功能研究

摘要

桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)隶属双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae，广泛分布于热带和亚热带地区。桔小实蝇寄主范围广、适应性、繁殖力以及扩散能力强，是一种重要的果蔬害虫。该虫成虫产卵于果实内，孵化后的幼虫通过潜居果瓤取食进行危害，造成果实腐烂、未熟先落，使果蔬的经济价值和食用价值大幅度降低。桔小实蝇的防治经历了一个从诱集防治到化学防治的过程，目前，由于大量不合理地使用化学杀虫剂，造成了桔小实蝇对多种常用杀虫剂产生了严重的抗药性。昆虫胰岛素信号的转导可以调节机体的生长发育、代谢、生殖以及衰老等重要生理过程。因此，阐明桔小实蝇胰岛素信号通路调控其变态发育的分子机制，可为寻找杀虫剂新的作用靶标提供理论基础。
　　本学位论文基于桔小实蝇转录组数据库信息，运用RT-PCR结合RACE技术，从桔小实蝇体内克隆获得了6个胰岛素信号通路基因的cDNA序列，并对其特征序列进行注释，利用qPCR技术解析了6个基因在桔小实蝇不同发育阶段、不同组织的表达特性，以及饥饿胁迫和激素处理后基因的应激表达模式;最后利用RNAi技术探索了胰岛素受体底物蛋白（Insulin receptor substrate）基因IRS在桔小实蝇卵巢发育中的作用。研究结果将有助于探索桔小实蝇胰岛素信号通路基因的功能及其调控机制，为桔小实蝇的持续防控提供新的思路和方法。主要研究结果如下:
　　1、桔小实蝇胰岛素信号通路6个重要基因的克隆与序列分析
　　根据从桔小实蝇转录组数据库筛选鉴定的unigene序列，克隆获得了桔小实蝇胰岛素信号通路6个重要基因的cDNA序列，分别为胰岛素受体(Insulin receptor，InR);胰岛素受体底物蛋白（Insulin receptor substrate，IRS）;磷脂酰肌-3-激酶(Phosphotidylinositol3 kinase，PI3K)—PI3K92E和PI3K21B;蛋白激酶B(ProteinKinase B，Akt/PKB);磷酸肌醇依赖性激酶(Phosphoinositide-dependent kinase，PDK)。GenBank登录号分别为KJ028005、KF305824、KJ028006、KJ011126、KJ011125和KJ011127。通过序列分析，明确了4个基因的开放阅读框，并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Scanprosite、NetNGlyc1.0、SignalP4.1以及TMHMM等生物信息学软件分析了6个基因推导的蛋白质的保守序列、跨膜结构、信号肽序列等潜在的生理功能。
　　2、桔小实蝇胰岛素信号通路6个重要基因的表达模式分析
　　2.1桔小实蝇胰岛素信号通路6个重要基因在不同发育阶段的表达模式
　　利用qPCR技术解析了胰岛素信号通路6个重要基因在桔小实蝇幼虫、蛹和成虫期的mRNA表达模式。结果表明，桔小实蝇胰岛素信号通路6个基因在幼虫-蛹和蛹末期的表达变化明显，其中InR、Akt/PKB和PDK主要在幼虫-蛹的转化过程中表达，而IRS、PI3 K21B和PI3192E在这一阶段表达量相对较低;所有胰岛素信号通路基因的mRNA水平在蛹后期均出现了明显的上调，推测胰岛素信号通路在桔小实蝇变态发育的过程中起着重要作用。同时，桔小实蝇胰岛素信号通路6个基因的表达具有明显的性别差异。除IRS在雄虫第7日龄的表达量明显高于雌虫外，其它基因均为雌虫的表达量高于同一日龄的雄虫，其中PI3K21B和InR在10日龄雌虫的表达量显著高于雄虫，Akt/PKB在4日龄的雌虫中的表达量明显高于雄虫。
　　2.2桔小实蝇胰岛素信号通路6个重要基因在不同组织的表达模式
　　利用qPCR和RT-PCR技术解析了胰岛素信号通路6个基因在桔小实蝇3龄幼虫的脑、脂肪体、马氏管、中肠、气管和表皮组织，以及成虫的头部、胸部、脂肪体、马氏管和中肠的表达模式。结果表明，6个基因均在桔小实蝇幼虫的脑部和成虫的头部出现了高水平表达;而IRS、PI3 K21B、PI3K92E和PDK也在幼虫马氏管和脂肪体高表达。推测胰岛素信号通路可能参与了脑部的神经分泌系统，并在信号传递中发挥着重要作用，而脂肪体是营养储存和能量代谢的主要器官。
　　3、外源激素和饥饿对桔小实蝇胰岛素信号通路6个重要基因表达的影响
　　3.1外源激素对桔小实蝇胰岛素信号通路6个重要基因表达的影响
　　将桔小实蝇3龄幼虫的脂肪体进行外源激素20E和JHA的处理。结果表明，两种激素处理12h后，IRS、PI3 K21B、Akt/PKB和PDK的表达量都出现了不同程度的上调，而PI3K92E的表达量在JHA处理后出现了显著下调;与其它基因不同，InR在两种激素处理后其表达量没有发生明显的变化。由此推测，桔小实蝇在外源激素的刺激下，可能通过提高部分胰岛素信号通路基因的转录水平使体内各激素达到动态平衡。
　　3.2饥饿对桔小实蝇胰岛素信号通路6个重要基因表达的影响
　　利用qPCR技术解析了桔小实蝇胰岛素信号通路6个基因在饥饿处理后表达量的变化。结果表明，除PI3K21B外，其余5个基因的表达水平在饥饿处理后明显上调。重新饲喂已饥饿处理的幼虫，这些基因的mRNA表达相对于持续饥饿的幼虫又出现下调。推测这可能昆虫的是一种应激机制，由此调整自身激素代谢平衡。
　　4、桔小实蝇IRS基因的功能研究
　　利用显微注射将体外合成的dsRNA导入桔小实蝇雌虫体内，并通过qPCR技术检测目的基因的沉默效果。结果表明，对桔小实蝇雌虫的IRS基因进行RNA干扰后，其mRNA表达水平明显下降，且雌虫卵巢的直径明显小于对照。另外，干扰24 h和48 h后IRS的表达受到抑制时，通路上其它基因的表达也受到了相应的抑制。然而，在IRS的表达受抑制72 h后，胰岛素信号通路的其它基因的表达量却出现了明显上调。推测其可能与昆虫在特殊条件下启动了相关补偿机制提升胰岛素信号通路中基因的表达量，从而保证胰岛素信号在虫体内的正常转导。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 胰岛素及其信号转导的研究概况

1．1．1 胰岛素

1．1．2 胰岛素信号通路

1．2 昆虫胰岛素信号通路

1．2．1 昆虫胰岛素受体及其信号通路中的其他成员

1．2．2 昆虫胰岛素信号通路的生理功能

1．3 饥饿与胰岛素信号的关系

1．4 昆虫胰岛素信号通路与其它昆虫激素信号的相互作用

1．4．1 胰岛素信号与蜕皮激素的相互作用

1．4．2 胰岛素信号通路与保幼激素的相互作用

1．5 胰岛素对昆虫脂肪体的影响

引言

第二章 桔小实蝇胰岛素信号通路基因的克隆及序列分析

2．1 材料和方法

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 主要仪器及试剂

2．1．3 总RNA提取

2．1．4 总RNA中gDNA的去除

2．1．5 cDNA合成

2．1．6 引物设计和合成

2．1．7 PCR扩增反应

2．1．8 克隆和测序

2．1．9 生物信息学分析

2．2 结果与分析

2．3 讨论

第三章 桔小实蝇胰岛素信号通路基因的发育阶段和组织表达特异性分析

3．1 材料和方法

3．1．1．供试昆虫

3．1．2 实验试剂及仪器

3．1．3 总RNA提取

3．1．4 cDNA合成

3．1．5 引物设计和合成

3．1．6 实时定量PCR

3．1．7 标准曲线制作

3．1．8 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 引物扩增效率

3．2．2 胰岛素信号通路基因在不同发育时期的表达分析

3．2．3 胰岛素信号通路基因在不同组织中的表达分析

3．2．4 胰岛素信号通路基因在成虫不同组织中的表达分析

3．3 讨论

第四章 外源激素和饥饿对桔小实蝇胰岛素信号通路基因表达的影响

4．1 材料和方法

4．1．1 供试昆虫

4．1．2 实验试剂及仪器

4．1．3 激素处理

4．1．4 饥饿处理

4．1．5 总RNA提取

4．1．6 cDNA合J戎

4．1．7 引物设计和合成

4．1．8 实时定量PCR

4．1．9 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 外源激素对桔小实蝇胰岛素信号通路基因表达的影响

4．2．2 饥饿对桔小实蝇胰岛素信号通路基因表达的影响

4．3 讨论

第五章 桔小实蝇IRS基因的功能分析

5．1 材料和方法

5．1．1 供试昆虫

5．1．2 实验试剂及仪器

5．1．3 dsRNA引物的设计

5．1．4 dsRNA合成

5．1．5 dsRNA检测

5．1．6 显微注射

5．1．7 RNA干扰水平检测和表型观察

5．2 结果与分析

5．2．1 dsRNA合成

5．2．2 沉默效率

5．2．3 表型变化

5．3 讨论

第六章 主要结论、创新点及研究展望

6．1 主要结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

缩略词表

发表论文与科研成果

致谢