烟草根结线虫生防菌的筛选及其技术体系的建立

摘要

烟草是一种重要的经济作物，烟草根结线虫病是世界烟草生产上的重要病害之一。在我国大部分烟草种植区均有发生，且多个省市危害严重。由于生产上所种植的烟草品种抗性程度不够，防治上仍然以化学药剂为主要防控手段。长期使用化学农药易导致根结线虫抗（耐）药性剧增、环境污染和烟叶重金属含量超标等影响防治效果、生态平衡和人类健康等问题出现。为此，本文针对烟草根结线虫病生防控制设计试验，试验内容主要是进行了拮抗菌株室内筛选及防效测定，拮抗菌温室盆栽验证以及拮抗菌株对烟草根结线虫发育进程影响的初步研究。通过本研究，从生防菌的初步筛选、拮抗菌对卵和二龄幼虫的拮抗试验、温室盆栽控病试验、同时调查统计根结线虫在植株根内发育进程受拮抗菌的影响等几个方面，建立一套较为系统、可行的根结线虫生防菌筛选体系。本研究的主要结果如下:
　　1、烟草根结线虫拮抗活性菌株初步筛选
　　分别利用实验室保存经前人研究对烟草病害具有良好控病作用的的45株菌株进行烟草根结线虫二龄幼虫抑杀测定，得到有拮抗活性的菌株13株，占待测菌总数的28.9％;其中真菌3株，细菌8株，放线菌2株。其中处理二龄幼虫校正死亡率超过70％的菌株共3株，分别为哈茨木霉菌YZL229(77.0％)，荧光假单胞杆菌P-72-10(74.0％)，枯草芽孢杆菌Itb162(72.3％)，占待测菌总数的11.1％。
　　2、拮抗菌YZL229，P-72-10，Itb162对烟草根结线虫卵和二龄幼虫的拮抗试验
　　通过初步筛选，分别选取对烟草根结线虫具有良好拮抗作用的哈茨木霉菌YZL229，荧光假单胞杆菌P-72-10，枯草芽孢杆菌Itb162对烟草根结线虫卵和二龄幼虫进行抑杀测定。结果表明，三种菌株不同浓度发酵液上清液均对烟草根结线虫的卵表现出较好的抑制作用。处理120h后，菌株发酵液对烟草根结线虫卵孵化的抑制作用从大到小为:YZL229＞P-72-10＞ Itb162。其中菌株YZL229发酵液原液抑制孵化作用最明显，菌株Itb162发酵液5倍稀释液抑制作用最小，但均与对照呈显著性差异。同样，三种菌株不同浓度发酵液上清液均对烟草根结线虫的二龄幼虫表现出较好的抑制作用。处理48h后，菌株发酵液对根结线虫二龄幼虫的抑杀作用从大到小为: YZL229＞P-72-10＞ Itb162。其中菌株YZL229发酵液原液在处理48h后对二龄幼虫的致死率高达94.7％，而菌株Itb162发酵液5倍稀释液对二龄幼虫的致死率为62.3％，均与对照具显著性差异。另外，还，针对菌株YZL229对烟草根结线虫卵作了寄生测定。结果表明，处理7d后菌株YZL229对根结线虫卵的寄生率高达73.4％，同时还发现该菌株对发育较成熟的卵具有较高的寄生率，而对未发育成熟的卵寄生率较低。
　　3、拮抗菌株对烟草根结线虫病的温室盆栽试验
　　选择拮抗试验中对烟草根结线虫具有良好拮抗作用的哈茨木霉菌YZL229，荧光假单胞杆菌P-72-10，枯草芽孢杆菌Itb162对烟草根结线虫进行温室盆栽试验。用灌根法先接种拮抗菌菌悬液14d后，再接种二龄幼虫，接种二龄幼虫60d后对烟草植株进行调查。试验结果表明，菌株YZL229，P-72-10和Itb162均对烟草根结线虫侵染有不同程度的抑制作用。三种拮抗菌均能不同程度的减小寄主植株的GI(egg index)和EMI(egg mass index)，均能不同程度的增加寄主植株的生长指数（叶片长度，根长，叶面积），均能增加寄主植株的干重和鲜重，同时也能减少寄主根围线虫密度和减少烟草根结线虫的产卵量。其中菌株YZL229具有三者之中最好的拮抗效果，其效果由大到小依次为:YZL229＞P-72-10＞ Itb162，三者均与发病对照具有显著性的差异，均展现了良好的生防潜力。
　　4、荧光假单胞杆菌P-72-10对烟草根结线虫发育进程的影响
　　选择经前人研究能定殖于烟草根表且对烟草根结线虫具有良好拮抗作用的荧光假单胞杆菌P-72-10菌株进行盆栽试验，分别于接种二龄幼虫后二龄幼虫侵染和不同时间段不同龄期对线虫发育进程进行调查，以直观的说明拮抗菌株P-72-10对烟草根结线虫发育进程的影响，从而验证其生防潜力。试验结果表明，接种二龄幼虫后第2d，4d，6d，8d，10d二龄幼虫侵染烟草植株数量逐渐增大，但经菌株P-72-10处理过的侵染率除第4d外均显著低于对照。接种后第10d对侵染的烟株进行移栽，在接种二龄幼虫第14d，21d，28d和35d对烟草植株根系内线虫进行调查统计。结果表明，经菌株P-72-10处理的烟株根系内的根结线虫与对照相比其发育进程受到了显著的抑制和延缓，这表明拮抗菌P-72-10能在整个根结线虫生活史时段中有效的抑制根结线虫的发育进程和繁殖，具有良好的生防潜力。
　　5、建立一套较为系统、可行的烟草根结线虫生防菌筛选技术体系
　　本研究利用初步筛选出的三株菌株从其对烟草根结线虫卵和二龄幼虫的抑制试验、温室控病试验，对侵染烟株不同发育进程根结线虫的影响三个不同角度充分验证了三种拮抗菌株对烟草根结线虫的生防潜力，建立起一套较系统、可行的烟草根结线虫生防菌筛选技术体系。在对烟草根结线虫卵和二龄幼虫的抑制试验中，针对可能对根结线虫卵和二龄幼虫具有寄生能力的真菌菌株进行了卵和二龄幼虫的寄生测定，同时利用三株拮抗菌株不同浓度发酵液上清液分别对卵进行孵化抑制试验和对二龄幼虫进行抑杀试验，同时观察统计二龄幼虫在不同浓度发酵液上清液中的行为特征，充分验证三株拮抗菌株的抑制效果;在温室盆栽控病试验中，利用三株菌株菌悬液对烟株进行灌根处理，调查其根结指数(GI)和卵块指数(EMI)及单位土壤中线虫数量，并从烟株的生长指数等方面充分说明菌株的控病能力;在进行三株菌株对侵染烟株后不同发育进程影响实验中，通过调查二龄幼虫的侵染率和线虫在烟株根部不同发育进程，表明菌株能在整个根结线虫生活史时段中对其发育进程具有有效的抑制作用。综合以上三个方面的实验结果，本研究从拮抗菌对烟草根结线虫卵和二龄幼虫及其在烟株内发育进程的抑制作用作出评价，从控制烟草根结线虫侵染源和侵染后发育进程等角度建立了一套系统可行的烟草根结线虫生防菌筛选技术体系，为验证生防菌的生防潜力提供有效技术手段。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．烟草根结线虫病

1．1 为害症状

1．2 病原特征

1．3 植物根结形成和根结线虫致病机理

1．4 侵染循环

2．拮抗微生物在根结线虫生物防治中的应用

2．1 食线虫真菌

2．2 拮抗细菌

2．3 其他拮抗微生物

3 拮抗微生物对根结线虫的作用机理

3．1 对根结线虫的寄生作用

3．2 产生毒素

3．3 改变根结线虫与根分泌物作用方式

3．4 生态位或营养竞争

3．5 提高寄主植株的抗病力

第二章 引言

第三章 烟草根结线虫拮抗菌的筛选及抑制试验

1．材料与方法

1．1 供试烟草根结线虫卵和二龄幼虫悬浮液的制备

1．2 待测菌株及培养基

1．3 待测菌株发酵液上清液的制备

1．4 主要仪器

1．5 待测菌对二龄幼虫的抑制作用筛选试验

1．6 掊抗菌YZL229，P-72-10，Itb162对烟草根结线虫卵和二龄幼虫的拮抗试验

2．结果与分析

2．1 待测菌筛选结果

2．2 拮抗菌YZL229对二龄幼虫卵的寄生测定结果

2．3 拮抗菌YZL229，P-72-10，Itb162对烟草根结线虫卵孵化的抑制试验结果

2．4 拮抗菌YZL229，P-72-10，Itb162对烟草根结线虫二龄幼虫的抑制试验结果

2．5 拮抗菌YZL229不同浓度发酵液上清液中二龄幼虫的行为特征

3．讨论

第四章 温室盆栽试验

1．材料与方法

1．1 供试烟草根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备

1．2 菌株YZL229，P-72-10，Itb162菌悬液的制备

1．3 供试烟草品种及烟苗的培育

1．4 温室盆裁试验

2．结果与分析

2．1 烟草根结线虫根结指数和卵块指数

2．2 烟草植株生长系数

2．3 烟草植株根和叶片的干重和鲜重

2．4 烟草根结线虫单位土壤线虫数

2．5 烟草根结线虫单位卵块卵的数量

3．讨论

第五章 荧光假单胞杆菌P-72-10对烟草根结线虫生长的影响

1．材料与方法

1．1 供试烟草根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备

1．2 荧光假单胞杆菌P-72-10菌悬液的制备

1．3 供试烟草品种及烟苗的培育

1．4 温室盆栽接种

1．5 不同时间段及不同发育龄期的烟草根结线虫数量

2．结果与分析

2．1 接种后第2，4，6，8和10天时烟草根结线虫数量

2．2 接种后第14天不同发育龄期根结线虫的数量

2．3 接种后第21天不同发育龄期根结线虫的数量

2．4 接种后第28天不同发育龄期根结线虫的数量

2．5 接种后第35天不同发育龄期根结线虫的数量及单位卵块卵的数量

3．讨论

第六章 展望与小结

1．小结

1．1 通过筛选，得到三株对烟草根结线虫拮抗作用较好的菌株

1．2 拮抗菌对根结线虫卵和二龄幼虫具有良好的抑制作用

1．3 拮抗菌对烟草根结线虫具有良好的温室控病效果

1．4 拮抗菌株P-72-10对烟草根结线虫发育进程具有有效的抑制作用

1．5 建立了一套系统、可行的烟草根结线虫生防菌筛选技术体系

2．展望

参考文献

硕士期间发表文章及参加科研项目情况

致谢