白腐真菌漆酶诱导表达的机制研究

摘要

漆酶是一种含铜或含铁的多酚氧化酶，其底物具有广泛性，是少数几种非特异性生物酶，能降解酚型和非酚型化合物，以及持久性的环境污染物。因此，漆酶被大量应用在纸浆造纸、纺织印染、酿造行业等工业废水的脱毒脱色降解，以及生物质能源开发的生物质前处理脱除木质素。漆酶在植物、真菌、细菌及昆虫体中广泛存在。迄今研究最多的是以白腐菌为代表的真菌漆酶，可以通过种间相互作用或外源化合物等多种诱导条件促进漆酶的大量合成，但是其诱导表达的机制尚不清楚。研究种间相互作用过程中漆酶的诱导表达机制，可以为种间作用途径生产漆酶提供理论依据，同时也可以为研究真菌间相互作用的代谢表达调控机制提供借鉴。本研究主要内容包括：
　　⑴通过平板对峙培养，在5株模式真菌中筛选出Trametes versicolor(TV)、Pleurotus ostreatus(PO)和Dichomitus squalens(DS)作为试验的漆酶生产菌。将这3株白腐菌两两组合共培养，测定其漆酶活性。结果显示，TV和DS的种间诱导酶活分别是单菌TV和DS的150倍和520倍;TV和PO的种间诱导酶活分别是单菌TV和PO的100倍和50倍;PO和DS的种间诱导酶活分别是单菌PO和DS的20倍和200倍。验证了外源化合物对3株白腐菌产漆酶的诱导效果:Cu2+具有很强的漆酶诱导能力，不同的芳香化合物和木质素衍生物对白腐菌产漆酶也具有一定的诱导效果。同时，初步探讨了营养物质对白腐菌产漆酶的影响，果糖和L-天冬酰胺为白腐菌共培养产漆酶最佳的碳氮源，草本植物的成分相对于木本更有利于白腐菌产漆酶。
　　⑵白腐菌在共培养条件下的胞外分泌物能诱导漆酶产生。通过在平板共培养体系中的半透膜装置验证了菌丝的物理接触对于漆酶种间诱导是非必须的。然后用有机试剂萃取菌丝交汇处的胞外分泌物，添加到单菌培养体系中验证其漆酶诱导能力。结果显示，共培养体系中菌丝交汇处的胞外分泌物对白腐菌产漆酶的确有显著的诱导效果。但是单菌的发酵上清液对白腐菌产漆酶没有显著的诱导效果。
　　⑶通过比较代谢组学和数字差异基因表达谱分析发现，菌丝交汇处相对于两侧的单菌发生了一系列的调控变化。种间共培养时，细胞处于防御与攻击状态，参与细胞攻击的水解酶、抗菌化合物等在基因水平和代谢水平上出现大量的上调表达;参与细胞防御的疏水蛋白、氧化还原酶及一些细胞色素等也出现大量的上调表达。同时细胞处于活跃状态，糖、脂类、氨基酸代谢等代谢途径的相关基因都发生上调表达，为细胞提供能量和物质基础。
　　⑷综合组学结果分析，白腐菌漆酶种间诱导机制:在种间作用下，细胞受体识别到对方细胞后，启动自身的攻击机制，产生活性氧中间体、氮反应中间体、抗菌性挥发性有机物及一些刺激性的代谢物等对对方细胞产生胁迫和伤害。对方细胞的漆酶基因启动子区域存在的响应元件会对这些物质产生相应的应答反应，启动自身的防御机制，导致漆酶的大量表达缓解这些胁迫和伤害。此外，分泌大量的水解酶破坏细胞完整性和种间营养物质的竞争也是诱导漆酶大量表达的原因。本研究为探索漆酶诱导的表达机制提供了分子水平的证据，为下一步鉴定白腐菌种间漆酶诱导的关键因子及代谢调控网络分析奠定了基础。同时，本研究为研究微生物间的相互作用提供了借鉴。

目录

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论文说明

摘要

第1章 文献综述及绪论

1.1 课题背景介绍

1.1.1 漆酶性质及催化反应机制

1.1.2 漆酶的应用

1.1.3 白腐菌产漆酶的诱导

1.1.4 菌株介绍

1.2 漆酶诱导机制研究现状

1.3 研究目标，内容及技术路线

1.3.1 研究目标

1.3.2 研究内容

1.3.3 技术路线

第2章 白腐菌漆酶诱导表达

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 漆酶生产菌株的选择

2.2.2 外源化合物诱导产漆酶

2.2.3 共培养诱导体系的优化

2.2.4 营养物质对种间诱导产漆酶的影响

2.3 本章小结

第3章 胞外分泌物的漆酶诱导

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 纯培养胞外分泌物的漆酶诱导

3.2.2 共培养胞外分泌物的漆酶诱导

3.3 本章小结

第4章 漆酶种闰诱导的组学分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 漆酶诱导活性

4.2.2 表达差异分析

4.2.3 代谢组分析

4.3 本章小结

4.3.1 抗菌机制

4.3.2 防御机制

4.3.3 漆酶种间诱导机制

第5章 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 展望

参考文献

致谢

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