牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选及其融合蛋白免疫效果的研究

摘要

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是巴氏杆菌属最重要的致病菌，属于革兰氏阴性菌，能够感染家养和野生动物，具有广泛的宿主谱。多杀性巴氏杆菌根据荚膜血清型的不同分为A、B、D、E和F5种血清群，根据LPS抗原性的不同又可将其分为16种血清型。近年来，综合国内外报道我们发现引起肉牛多杀性巴氏杆菌病的主要血清型是A型和B型，而且A型多杀性巴氏杆菌疾病呈逐年上升趋势。目前，预防牛源巴氏杆菌病的疫苗主要是针对B型多杀性巴氏杆菌的灭活疫苗，虽然该类疫苗在控制牛源巴氏杆菌病中起到了重要的作用，但是对不同血清型的交叉保护性弱。因此，需要开发一种安全有效，并能提供交叉保护性的新型疫苗来预防多杀性巴氏杆菌疾病，而牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选，为该新型融合疫苗的研究奠定了基础。
　　目前相关研究发现，ompA、ompH、PlpE、pm0979、P6以及pfhB6种抗原能对单一血清型提供一定的保护率，而且，在多种血清型中保守性极高。但是，在这些成分中哪些能提供交叉保护性作用还是未知。因此，本研究以这6种抗原基因作为研究对象，在相同免疫剂量与攻毒剂量的前提下，进行了如下研究:
　　1、牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的初步筛选
　　以牛源A型Pm CQ2株基因组为模板，利用PCR技术对6种保护性抗原基因进行扩增，构建相应的原核表达载体，并转化至感受态细胞BL21进行表达，同时对表达产物进行纯化以及Western blot鉴定。用纯化后的蛋白皮下免疫小鼠，于二免21 d后，用ELISA法检测小鼠体内抗体产生情况，并用2 LD50 Pm CQ2株(4.4×105cfu)、PmB型（2.96×104 cfu）腹腔攻毒，计算小鼠存活率。结果显示，rPM0979、rPLPE以及rOMPH三种蛋白对A型和B型多杀性巴氏杆菌均提供了良好的保护性，其中对PmA型保护率分别为40％、70％、60％，对PmB型保护率分别为30％、40％、30％。结果提示，蛋白rPM0979、rPLPE以及rOMPH具有交叉保护性，可作为后续研制融合疫苗的潜在蛋白。
　　2、牛源多杀性巴氏杆菌pm0979-ompH融合基因的表达及其表达产物的交叉保护性研究
　　通过生物信息学分析获得pm0979、ompH基因的主要抗原表位片段，并将两个基因片段用3种不同长度的疏水性linker进行拼接融合（标记为pm0979-L6-ompH、pm0979-L10-ompH、pm0979-L15-ompH）。对融合基因进行表达，并对表达的蛋白进行纯化及Western blot分析，最终以rPM0979、rOMPH、rPM0979-L6-OMPH、rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH蛋白免疫小鼠后进行Pm CQ2株、PmB型攻毒试验，分别测定小鼠体内抗体产生情况以及对小鼠的交叉保护性效果。结果显示，表位基因表达的单一蛋白的交叉保护性与之前的全长基因表达的蛋白相比较，其交叉保护性有所降低，但融合蛋白的相对来说都有所提高;其中，融合蛋白rPM0979-L6-OMPH对Pm CQ2株攻毒的小鼠保护率为60％，对PmB型攻毒小鼠保护率为20％，融合蛋白rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH对Pm A型攻毒的小鼠保护率为70％，对PmB型攻毒小鼠保护率为30％。结果提示，3种rPM0979-OMPH融合蛋白对小鼠具有良好的交叉保护性，其中融合蛋白rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH交叉保护性效果较好;同时该结果还提示，不同linker长度的融合蛋白对小鼠的保护率不同，而且linker的最佳长度为10aa。
　　3、牛源多杀性巴氏杆菌pm0979-PlpE融合基因的表达及其表达产物的交叉保护性研究
　　通过生物信息学分析获得了pm0979、PlpE基因的主要抗原表位，将pm0979、PlpE基因通过长度为10aa的linker相连，构建融合基因pm0979-L10-PlpE。对融合基因进行表达，并对表达的蛋白进行纯化及Western blot分析。通过小鼠试验评价重组蛋白rPM0979-L10-PLPE的交叉保护性。结果表明，融合蛋白rPM0979-L10-PLPE对PmA型攻毒小鼠的保护率为80％，对PmB型攻毒小鼠的保护率为40％。结果提示，融合蛋白rPM0979-L10-PLPE具有很好的交叉保护性。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 多杀性巴氏杆菌的基本分类

1．2 多杀性巴氏杆菌引起的动物疾病

1．3 多杀性巴氏杆菌致病基因组学

1．4 多杀性巴氏杆菌的毒力机制

1．4．1 宿主环境

1．4．2 表面成分

1．4．3 PMT

1．4．4 抗生素耐药性

1．5 治疗和预防

1．5．1 抗生素

1．5．2 疫苗

1．6 融合蛋白

1．6．1 融合蛋白技术

1．6．2 融合蛋白连接肽的选择

1．6．3 连接肽应用中出现的问题及解决方法

1．7 展望

第2章 引言

2．1 研究目的及意义

2．2 研究的主要内容

2．2．1 牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选

2．2．2 牛源多杀性巴氏杆菌pm0979-ompH融合基因的表达及其表达产物的交叉保护性研究

2．2．3 牛源多杀性巴氏杆菌pm0979-PlpE融合基因的表达及其表达产物的交叉保护性研究

2．3 技术路线

第3章 牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选

3．1 实验材料

3．1．1 菌种与质粒

3．1．2 酶及生化试剂

3．1．3 实验动物

3．1．4 主要仪器设备

3．1．5 主要试剂的配制

3．2 方法

3．2．1 引物的设计与合成

3．2．2 目的基因的扩增

3．2．3 目的基因原核表达载体的构建

3．2．4 目的基因的表达

3．2．5 重组蛋白的纯化

3．2．6 目的蛋白的Western-blot分析

3．2．7 小鼠攻毒保护性试验

3．3 结果

3．3．1 目的基因的扩增

3．3．2 目的基因表达产物的鉴定

3．3．3 小鼠攻毒保护性试验结果

3．4 讨论

3．4．1 牛源多杀性巴氏杆菌保护性抗原的选择

3．4．2 目的蛋白的纯化及复性

3．4．3 牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选

第4章 牛源多杀性巴氏杆菌pm0979-ompH融合基因的表达及其表达产物的交叉保护性研究

4．1 材料

4．1．1 菌种

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要试剂的配制

4．1．4 实验动物

4．1．5 主要仪器设备

4．2 方法

4．2．1 pm0979、ompH优势抗原表位的筛选

4．2．2 引物的设计与合成

4．2．3 目的基因的扩增

4．2．4 融合基因pm0979-ompH的生物信息学分析

4．2．5 目的基因原核表达载体的构建

4．2．6 目的基因的表达与纯化

4．2．7 目的蛋白的Western-blot分析

4．2．8 小鼠攻毒保护性试验

4．3 结果

4．3．1 pm0979、ompH优势抗原表位的筛选

4．3．2 pm0979、ompH基因及pm0979-ompH融合基因的扩增

4．3．3 融合基因pm0979-ompH的生物信息学分析

4．3．4 融合基因表达产物的鉴定

4．3．5 小鼠攻毒保护性试验结果

4．4 讨论

4．4．1 多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的选择

4．4．2 linker的选择

4．4．3 牛源多杀性巴氏杆菌融合蛋白对小鼠的交叉保护性

第5章 牛源多杀性巴氏杆菌pm0979-PlpE融合基因的表达及其表达产物的交叉保护性研究

5．1 实验材料

5．1．1 菌种与质粒

5．1．2 酶及生化试剂

5．1．3 实验动物

5．1．4 主要仪器设备

5．2 方法

5．2．1 pm0979、PlpE优势抗原表位的筛选

5．2．2 引物的设计与合成

5．2．3 目的基因的扩增

5．2．4 融合基因pm0979-PlpE的生物信息学分析

5．2．5 目的基因原核表达载体的构建

5．2．6 目的基因的表达与纯化

5．2．7 目的蛋白Western-blot分析

5．2．8 小鼠攻毒保护性试验

5．3 结果

5．3．1 pm0979、PlpE抗原表位的筛选

5．3．2 目的基因的扩增

5．3．3 融合基因pm0979-PlpE的生物信息学分析

5．3．4 目的基因表达产物的鉴定

5．3．5 小鼠攻毒保护性试验结果

5．4 讨论

第6章 结论

6．1 牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的初步筛选

6．2 牛源多杀性巴氏杆菌pm0979-ompH融合基因的表达及其表达产物的交叉保护性研究

6．3 牛源多杀性巴氏杆菌pm0979-PlpE融合基因的表达及其表达产物的交叉保护性研究

参考文献

附表

致谢

硕士期间发表论文一览表及参与的科研项目