几种植物源化合物对青枯菌的抑制作用及机理研究

摘要

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是一种能够引起植物青枯病的土传性病原细菌。该病原菌主要分布在热带、亚热带和部分温带地区，能够浸染50余科百余种作物，造成重大的经济损失。青枯雷尔氏菌与寄主、环境长期协同进化过程中，在形态、种下分化、致病性、致病机理等方面表现出高度的复杂性，这种复杂性致使植物青枯病的难防难治。长期以来，青枯雷尔氏菌的防治措施主要依赖于化学农药及采用抗性品种、无菌嫁接和轮作等，但是防治效果不理想，而且还存在环境污染和抗性等问题。植物本身存在着丰富的天然抗菌物质，这些抗菌物质具有快速分解、环境友好和不易产生抗性等特点。因此，从植物材料出发获得对防治青枯菌高效和环境友好兼容的天然活性化合物具有重要意义。本论文筛选对青枯菌具有抑菌活性的植物源化合物，通过评价抑制效果、探究抑菌机制、进行室内防控效果和对致病力的影响等试验，以期获得对青枯菌具有较强的抑菌活性物质，为研究植物源化合物对青枯菌的抑病机制和探讨细菌性青枯病的防治提供新的思路，为开发、研制新型生物农药提供可靠的理论与实践依据。
　　1、评价了14种对青枯雷尔氏菌具有抑菌活性的植物源化合物，明确了原儿茶醛、香荆介酚、香豆素和白藜芦醇四种化合物抑菌活性较好。试验采用100μg/mL和10μg/mL处理青枯菌后检测菌量并评价抑菌活性。结果显示原儿茶醛、香豆素、香荆介酚和白藜芦醇在两个浓度下均有抑菌效果，其中在100μg/mL浓度下抑菌率分别达到99.40％、96.04％、84.66％和70.27％，与其他化合物存在显著性差异，而10μg/mL浓度下各处理间差异不显著。确定原儿茶醛、香豆素、香荆介酚和白藜芦醇作为候选化合物开展进一步研究。
　　2、测定了香豆素、原儿茶醛、香荆介酚和白藜芦醇对青枯菌最小抑菌浓度MIC与最小杀菌浓度MBC，以及四种物质对青枯菌生长的影响。结果表明，原儿茶醛的MBC为40μg/mL，在液体培养基中随浓度增大对青枯菌生长的抑制作用越强，其中64μg/mL浓度下菌株生长完全受到抑制;白藜芦醇与香豆素的MIC和MBC分别为230μg/mL、230μg/mL与110μg/mL、110μg/mL，且两种物质均在128μg/mL浓度下对生长的抑制作用最为明显;香荆介酚对菌株的抑制效果随着浓度的增加而增加，MIC和MBC分别为210μg/mL和250μg/mL。
　　3、明确四种植物源化合物对青枯雷尔氏菌菌株形态及结构的影响。利用扫描电镜观察处理后青枯菌的菌态，结果表明:原儿茶醛处理后菌株细胞形态变长呈细腰状，可能为抑制细菌分裂生殖而抑制菌株生长;白藜芦醇处理后菌态表现为不完整，边缘模糊，推断白藜芦醇可能为破坏了青枯菌的细胞壁或细胞膜的完整，致使出现内质外流细胞塌陷;香豆素可能是改变细胞膜通透性而导致内外渗透压的失常，进而引起细胞表面凸起和破裂抑制了细菌的生长;香荆介酚处理后的细菌菌态呈现为畸形，细胞膜不完整。
　　4、研究植物源化合物处理下青枯菌运动性和生物膜的变化，明确化合物对青枯菌前期侵染的影响。结果表明，原儿茶醛能够明显抑制菌株的运动性，但是能够促进生物膜的形成;白藜芦醇和相近介酚对青枯菌运动性和生物膜均有明显的抑制作用;香豆素对运动性和生物膜影响较小。
　　5、四种植物源化合物对青枯菌的致病相关基因有显著的影响。利用RT-PCR技术研究四种化合物对与致病力相关基因的表达的影响，试验数据显示与对照相比白藜芦醇处理后pilT、egl和epsB的表达量均显著性的下调;香豆素处理后pilT的表达量明显下调;原儿茶醛能够显著性的增加egl基因的表达;香荆介酚对pilT和epsB的表达具有明显的促进作用，但是对egl和pehC没有显著性的影响。
　　6、盆栽试验表明四种植物源化合物对青枯菌的前期侵染有较好的抑制效果。分别测定伤根接菌和不伤根接菌两种情况下植物源化合物对青枯病的防控效果，及在不伤根情况下化合物对菌株在烟株根部定殖和粘附的影响。结果表明在不伤根接菌的情况下，白藜芦醇和香豆素对菌株前期的粘附和定殖有明显的抑制作用，原儿茶醛对青枯菌定殖和粘附有一定的促进作用，但3种化合物对烟草青枯病发生有明显的推迟和延缓作用;香荆介酚对菌株粘附和定殖没有明显的影响，对烟草青枯病没有明显的防控效果。然而，在伤根条件下，四种植物源化合物没有明显的防治效果。因此，可以推断植物源化合物的作用主要表现在青枯菌对烟株的前期侵染阶段，而侵入后没有显著效果。
　　总之，通过试验证明香豆素、原儿茶醛、香荆介酚和白藜芦醇对青枯雷尔氏菌均具有抑菌效果，探究抑菌机制发现处理对青枯菌细菌形态有不同程度的损伤，其运动性与生物膜的形成受到一定的抑制，且显著影响了与致病力相关的基因的表达。而进一步的盆栽试验结果证实了四种化合物均有一定的防治效果，且防治作用主要表现在侵染前期。本论文首次探讨了香豆素、原儿茶醛、香荆介酚和白藜芦醇四种植物源化合物对植物病原细菌青枯雷尔氏菌的抑菌活性与机制，为研究发展植物性新农药防治植物青枯病提供了重要依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 青枯雷尔氏菌的复杂性

1．1 青枯菌分布广、危害重

1．2 青枯菌致病机理的复杂性

1．3 青枯菌复杂的基因

2 青枯病的防治现状

2．1 化学防治

2．2 农业防治

2．3 生物防治

3 植物源抑菌活性物质的研究现状

3．1 植物源抑菌活性物质

3．2 植物源抑菌活性物质的作用机理

3．3 植物源抑菌活性物质对青枯雷尔氏菌的防治研究

4 选题意义及研究内容

4．1 选题意义

4．2 研究内容

第二章 植物源化合物对青枯菌的抑菌活性评价

第一节 具有抗青枯菌活性植物源化合物的筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第二节 四种植物源化合物对青枯菌的抑菌活性测定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第三章 四种植物源化合物对青枯菌的抑制机制

第一节 四种植物源化合物对青枯菌菌体形态的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第二节 四种植物源化合物对青枯菌致病力的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第三节 四种植物源化合物对青枯菌与致病力相关基因的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第四章 四种植物源化合物在盆栽条件下对青枯病的防控效果

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 植物源化合物对青枯菌粘附和定殖能力的影响

2．2 植物源化合物对烟草青枯病的防控效果

3 结论与讨论

3．1 结论

3．2 讨论

第五章 主要结论与展望

1 主要结论

2 展望

参考文献

致谢