快速检测土壤中酞酸酯的免疫分析技术研究

摘要

酞酸酯（PAEs）又名邻苯二甲酸酯，作为增塑剂被广泛应用于工业生产和塑料制品中，具有持久性有机污染物（POPs）的特性，广泛存在于大气、水、土壤和生物等环境中。PAEs是环境内分泌干扰物，进入动物体内会产生类雌激素作用，阻止与动物生殖和发育有关的激素的合成、分泌、贮存、运输、结合和清除等过程，干扰血液维持正常的激素水平，具有致癌性、致畸性和致突变性。1977年，美国环保署（USEPA）将6种PAEs类化合物列入重点控制污染物名单，包括邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二正辛酯（DnOP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）和邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）；20世纪80年代，我国也将DMP、DBP、DnOP列入环境优先污染物黑名单。
　　我国是设施农业种植面积最大的国家，设施模式以塑料大棚和地膜覆盖为主。PAEs能够从农膜中释放进入土壤，加之破碎和废弃的农膜能够在土壤中长期存在，不仅破坏土壤结构、退化土壤功能，还会通过作物吸收影响农产品安全，危害人体健康。因此，准确测定土壤中PAEs的含量，对于保护农业生态环境、保证农产品安全和保护人体健康都具有十分重要的意义。PAEs的测定方法在早期主要有比色法、滴定法和分光光度法等，但这些方法的灵敏度低，选择性差。目前，一些仪器分析技术被应用于PAEs检测，主要包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）和液相色谱-质谱联用法（LC-MS）等。尽管仪器分析法的灵敏度和精密度高，但是它们存在样品前处理复杂、操作繁琐耗时、仪器昂贵和不能在线连续分析等问题，迫切需要发展简便、快速、灵敏、可靠的检测技术。
　　近年来，基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析方法成为研究热点。以固相载体吸附抗原-抗体为基础的酶联免疫分析法（ELISA），不需要昂贵的仪器，具有特异性强、灵敏度高、简便快捷等特点，在现场筛选和大量样本的快速检测中显示出独特优势，已广泛应用于临床诊断、药物筛选和环境分析与监测等领域。针对PAEs的免疫检测，目前国内外已经开展了一些研究工作，建立了时间分辨荧光免疫分析法、直接竞争ELISA法、竞争荧光免疫法和间接竞争ELISA法，但是这些方法的线性范围较窄、灵敏度较低，制备的抗体只能识别单一PAEs，难以满足同时检测环境中多种PAEs的实际需要。为此，本文以美国环保署优先监测的6种PAEs、增塑剂中常用的邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）和邻苯二甲酸二壬酯（DNP）为检测对象，基于PAEs类化合物的共性结构特征，设计并合成了2种半抗原，制备免疫原和包被原，研制抗PAEs的特异性抗体，建立检测PAEs的间接竞争酶联免疫吸附分析法（ic-ELISA）和光纤免疫传感技术，并成功应用于设施菜地土壤中PAEs的快速灵敏检测，取得了如下主要研究成果：
　　1.以4-硝基邻苯二甲酸为起始化合物，经过酯化、还原和酰胺化等反应，成功合成了检测PAEs的2种半抗原（I和II），研制的人工抗原具有载体蛋白和半抗原的特征吸收峰，初步说明偶联成功。两种免疫原（半抗原I-BSA和半抗原II-BSA）中蛋白浓度分别为4.28和5.35 mg·mL-1，包被原（半抗原I-OVA和半抗原II-OVA）中蛋白浓度分别为2.78和2.05 mg·mL-1。半抗原I、II与BSA的结合比分别为11:1和8.5:1，与OVA的结合比分别为6.5:1和4:1，通过薄层层析（TLC）、核磁共振氢谱（1HNMR）和质谱表征，说明人工全抗原的成功合成。
　　2.用制备的人工抗原免疫新西兰大白兔，获得从A1和A2兔（以半抗原I-BSA为免疫原）产生的抗体效价分别为1:12800和1:25600，B1和B2兔（以半抗原II-BSA为免疫原）产生的抗体效价分别为1:12800和1:12800。基于A2兔获得的抗血清效价最高，进一步纯化该抗血清，获得抗体中蛋白含量为2.959 mg·mL-1。
　　3.采用ic-ELISA法，优化并获得PAEs的最佳检测条件：包被原浓度和抗血清的稀释倍数分别为0.5μg·mL-1和1:3200，磷酸盐缓冲溶液（PBS）的pH和盐浓度分别为7.4和0.01 mol·L-1，酶标二抗稀释度为1:2000，抗原和一抗反应60 min， PAEs标准溶液中甲醇含量为10％。在最佳检测条件下，以PAEs类化合物的浓度对数值为横坐标，抑制结合率（B/B0）为纵坐标，绘制标准抑制曲线，获得DMP、DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DCHP和DNP的检出限分别为0.013、0.013、0.012、0.042、0.035、0.021、0.017和0.016μg·L-1，抗体与8种PAEs的交叉反应率分别为100%、83.84%、76.84%、35.77%、39.22%、44.01%、16.69%和26.51%，表明该抗体具有较宽的识别范围；对DMP的IC50为17.12μg·L-1，线性范围为0.08~363.9μg·L-1。对空白土壤样品进行加标回收实验，在加标水平为5、10和100μg·kg-1时，获得的平均回收率为63.9%~103.6%，RSD<11.32%；GC-MS法的平均回收率为68.3%~101.4%，RSD<10.39%，两种方法取得了一致的结果。建立的ic-ELISA法拓展了PAEs检测的线性范围，检出限明显降低，简化了样品前处理步骤，测定时间仅需4.5 h，并成功应用于设施菜地土壤中PAEs的检测。
　　4.构建光纤倏逝波免疫传感器，用Cy5.5 NHS酯标记抗体，优化并获得PAEs的最佳检测条件：包被原浓度为50μg·mL-1，PBS溶液的pH和盐浓度分别为7.4和0.01 mol·L-1，PAEs-抗体预反应时间为5 min。在最佳检测条件下，以PAEs类化合物的浓度对数值为横坐标，抑制结合率为纵坐标，绘制标准抑制曲线，获得DMP、DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DCHP和DNP的检出限分别为0.147、0.153、0.148、0.342、0.337、0.285、0.317和0.156μg·L-1，抗体与8种PAEs的交叉反应率分别为100%、71.94%、62.66%、31.14%、51.8%、42.85%、16.63%和22.75%；对DMP的IC50为9.54μg·L-1，线性范围为0.22~145μg·L-1。传感器具有良好的稳定性和再生性能，使用相同浓度的标记抗体，探头进行60次检测，响应信号没有明显下降。对空白土壤样品进行加标回收实验，在加标水平为5、10和100μg·kg-1时，获得的平均回收率为61.5%~106.7%，RSD<13.41%；GC-MS法的平均回收率为66.1%~104.5%，RSD<11.63%，两种方法取得了一致的结果。建立的光纤免疫传感检测技术具有较宽的线性范围和较高的灵敏度，样品仅需简单提取，在15 min内完成测试，并成功应用于设施菜地土壤中PAEs的检测。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1.1 概述

1.2 PAEs的污染途径

1.3 PAEs污染现状

1.4 PAEs的测定方法

1.5 酶联免疫分析技术

1.6 光纤免疫传感检测技术

1.7 总结与展望

第二章 引言

2.1 选题依据

2.2 研究内容

2.3 本研究的意义

2.4 技术路线

2.5 研究目标

第三章 检测酞酸酯半抗原和人工抗原的合成

3.1 材料与方法

3.2 实验步骤与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 检测酞酸酯多克隆抗体的制备与鉴定

4.1 材料与方法

4.2 实验步骤与方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 间接竞争酶联免疫吸附法测定酞酸酯

5.1 主要试剂与仪器

5.2 GC-MS测定条件

5.3 实验步骤与方法

5.4 结果与讨论

5.4 本章小结

第六章 光纤免疫传感器检测酞酸酯

6.1 主要试剂与仪器

6.2 实验步骤与方法

6.3 结果与讨论

6.4 本章小结

第七章 结论与建议

7.1 结论

7.2 主要创新点

7.3 建议

参考文献

致谢

攻读博士学位期间的科研成果和参加的科研项目