桑树雌花形成中乙烯作用机制的研究

摘要

花性调控的研究一直以来是生物学家关注的热点，果桑，叶用桑，生态桑等不同用途品种的开发对桑树花性别要求不同。桑树种质资源研究的传统方法为通过杂交育种筛选出优良性状，然后通过无性繁殖（扦插或嫁接）的方式增加群体数量。杂交育种存在周期长，效率低的缺点，对于不同需求品种的开发，如果能通过分子学手段在植株生长早期鉴定到其性别，将缩短育种周期，避免育种与生产中的浪费。因此，对桑树花性调控的研究具有极大地理论价值和经济价值。
　　乙烯是一种重要的气体植物激素，参与调节多种植物生长、发育过程，并能响应多种外部信号，如种子萌发、幼苗发育、果实成熟、叶片衰老、花性分化和抵抗生物与非生物胁迫等。乙烯作为植物的性别激素调控花器官性别分化，黄瓜的两个性别决定基因（F、M）经鉴定为乙烯合成的限速酶ACS家族的基因。
　　桑树花性分雌花、雄花、雌雄同花、雌雄同穗等，根据每株树开花的不同又分为雌雄同株，雌雄异株。桑树花性的主要决定因素是遗传因子。另外桑树花性也受到激素、环境等因素的影响。偏雄性的植株在喷施乙烯利后，出现了更多的雌花，而使雄花减少。赤霉素与乙烯利作用相反。构建桑树花芽性别分化时期的基因连续表达谱，将有助于研究乙烯与雌花发育的关系，并为筛选性别决定基因，构建同基因型雌雄异株育种材料等提供丰富的研究数据，加快桑树育种速度。
　　本研究首先通过生物信息学的方法鉴定了桑树中乙烯合成与信号传导相关的基因，结合多种软件分析了其基因结构，保守结构域和系统发生关系。进一步检测其在六个不同组织（根、皮、叶、雄花、雌花、果）中的表达模式。我们还鉴定了响应乙烯信号的AP2/ERF转录因子家族的基因，分析了其序列信息及在多种组织中的表达情况。随后我们选取了开雌花的珍珠白作为实验材料，用石蜡切片的方法确定了其花芽发育时期形态变化，从中选择包括花性分化时期的6个样本进行转录组测序，对测序结果进行了差异基因分析，KEGG功能富集分析，聚类分析，并重点选取激素相关基因、AP2/ERF家族基因和MADS-box家族基因进行了表达分析，随后选取特异表达基因进行了共表达分析。通过原位杂交的方法研究了乙烯合成关键基因在花芽中的表达位置。通过乙烯利（分解生成乙烯）和AVG（抑制乙烯的合成）两种药物处理珍珠白花芽检测了AP2/ERF家族基因表达的变化。最后构建了4个AP2/ERF转基因过表达载体，在烟草中验证其功能。本研究所获得研究结果如下：
　　1、桑树乙烯合成与信号传导相关基因鉴定及生物信息学分析
　　结合使用blast与HMM search两种方法在川桑基因组中共鉴定到29个乙烯合成与信号传导相关基因及116个 AP2/ERF家族基因。基因位置显示 MnEIN3、MnEIL1和MnEIL4、MnEIL5分别都定位在桑树基因组的同一个scaffold上。对四个较重要家族（ACS、ACO、ETR、EIN3）的基因进行了克隆验证。基因结构预测显示桑树中这四个基因家族，除了MnEIL4外，其他基因与以往研究的同源基因具有一致的基因结构。结构域分析显示MnACS5由于C末端缺失，缺乏相应的磷酸化位点，其他MnACS家族基因都含有保守的功能基序。MnACO家族基因都含有保守的功能基序。ETR家族中MnEIN4在N端含有一个信号肽结构，MnERS1蛋白C末端相对其他成员较短，导致其缺失一个信号接收结构域。MnEIN3家族中，除保守的结构域外，MnEIN3和MnEIL1还含有在绿豆基因中发现的两个保守的富含谷氨酸和天冬氨酸的区域。检测这四个基因家族在六个桑树组织（根、皮、叶、雄花、雌花、果）中的表达发现，基因表达模式多样，同时有一些组织特异表达的基因，其中MnACS5在雌花中特异表达。MnACO1和MnACO2在果实中特异表达。MnEIN3和MnEIL1在根和果中显示更高的表达。
　　AP2/ERF转录因子响应乙烯信号，按结构分为5个亚家族。各亚家族基因数目为ERF(58)、DREB(33)、AP2(21)、RAV(3)、Soloist(1)。按系统发生树分析又分为15个群。DREB亚家族包括（I-IV）群，ERF亚家族包括（V-X）群。其中V群基因中，桑树有11个成员，而拟南芥中仅含有5个成员。检测含有EAR（DLNXXP、LXLXL、LDLNLXPP）基序的基因显示，含 LXLXL基序的基因数目最多，另外MnERF亚家族含EAR基序的基因主要集中在MnERF-B1亚群。基因表达模式表明其有不同的表达模式。其中MnERF-B3-21在雄花中特异表达，MnDERB-A4-7在叶中更丰富，MnAP2-5在雄花中有高水平表达，另外有9个基因在任何组织中都没有检测到表达，推测这些基因响应某种特殊的外界刺激或内部环境信号。
　　2、桑树早期花芽发育形态变化及转录组分析
　　选取仅开雌花的珍珠白做为实验材料，通过石蜡切片技术观察其花芽发育时期的形态变化，选取其中包括花性分化时期的6个花芽样本（flwoer bud，FB）进行转录组测序，分别命名为 FB1-FB6。测序结果显示共得到118584个contigs与87719个unigenes。其中unigenes的平均长度为727 bp，中间长度为381 bp，最大长度为16738 bp，N50和N90分别为1307 bp和282 bp。功能注释结果显示有45.44％的基因可以至少在一个数据库中得到注释，其中在 Nr库中得到注释的基因最多（39.64%），仅有6.78%的基因在所有数据库中都能得到注释。通过blast和estscan分别得到35536（40.5%）条和26726（30.4%）条可编码蛋白质的序列。我们采取两种方式寻找差异基因。第一种为相邻时间点间差异表达基因，数目为808个。第二种为其他时间点与FB1之间差异表达基因，数目为1037个。所有差异基因一起聚类分析显示大多数差异基因在FB2和FB3上调，随后被下调表达。
　　差异基因KEGG富集分析显示FB1与FB2之间的差异基因显著富集在植物激素信号途径、磷脂酰肌醇信号系统、α-亚麻酸代谢、磷酸肌醇代谢和类黄酮合成五个途径。而在FB3和FB4之间的差异基因同样富集在除类黄酮合成之外的四个途径。植物激素信号途径KEGG通路显示，在FB1与FB2之间的差异基因中，乙烯信号途径的EBF1/2基因发生了下调表达，暗示了EIN3转录本可能得到积累并激活了下游的响应因子。
　　激素相关基因表达分析显示乙烯合成限速酶基因MaACS2在FB2表达迅速升高，而生长素中部分基因也在这个时间段高表达。油菜素内脂基因主要在 FB2和FB3时期表达，赤霉素基因主要在FB4-FB6表达较高，脱落酸基因主要在FB6表达较高。
　　AP2/ERF家族基因表达模式多样，其中有一部分仅在FB2和FB3表达较高。而在MADS-box家族中有接近一半基因的FPKM是随时间逐渐增加的。我们分别以这两类基因作为特征表达模式，与所有在任一样本中FPKM>5的基因进行共表达分析，鉴定到具有强关联的两群基因（P19对应AP2/ERF，P24对应MADS-box）。构建网络图显示 P19中200多个基因之间显示强关联度，P24网络图显示了相对松散的结构，其中具有40个以上链接的基因仅有一个，20-40个链接的基因有2个，10-20个链接的基因有10个。
　　3、珍珠白MaACS2与4个AP2/ERF基因功能分析
　　MaACS2原位杂交结果表明其主要在花序的外围表达，切片形态数据显示在这个阶段花芽中花器官开始分化，这些结果暗示桑树花芽性别分化过程中乙烯合成量增加，推测单性花形成属于第一种花性别分化模型，即在花器官发育早期形成两性起始原基，随后雌花中的雄蕊原基发育受到抑制，这个过程可能是乙烯在花器官分化早期大量形成的结果。TENUL检测显示在花萼内侧有显著的绿色荧光信号，暗示乙烯通过导致细胞凋亡抑制雄蕊的发育。
　　采用AVG与乙烯利处理FB2时期的花芽，随后检测有关基因的表达，结果显示乙烯利处理后MaDREB-A1亚群在第7天表达显著升高；而AVG处理后，相关基因表达与以往研究不一致。在烟草中异源表达AP2/ERF基因导致烟草花发育异常，花瓣发育不全，雌蕊突出，雄蕊数量减少且部分雄蕊发育异常。
　　本研究通过生物信息学的方法在川桑基因中鉴定到29个乙烯合成与信号传导相关基因，序列分析表明，其在序列结构，保守结构域和系统进化等方面与其他物种具有较高的保守性，暗示其可能发挥同样的功能。珍珠白花芽早期发育形态变化及转录组分析，显示在花芽中花器官分化时期有大量基因表达变化剧烈。乙烯合成限速酶基因MaACS2在FB2表达显著增加，生长素协同乙烯一起发挥作用，暗示乙烯在雌花发育中发挥一定的作用。MaACS2原位杂交结果显示其表达在花序的外围。TENUL检测显示花萼内侧存在细胞凋亡现象，转基因烟草花发育异常，这些结果暗示珍珠白雌花发育过程中，乙烯可能通过引起细胞凋亡发挥抑制雄蕊，促进雌蕊发育的作用。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1.1植物花性研究进展

1.2植物激素乙烯研究进展

1.3桑树花性研究进展

1.4结语

第二章 引言

2.1研究目的及意义

2.2主要研究内容

2.3研究路线

第三章 桑树乙烯合成与信号传导相关基因的鉴定、克隆及信息学分析

3.1材料与数据

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4总结与讨论

第四章 桑树早期花芽发育形态变化及转录组分析

4.1材料与方法

4.2试验方法

4.3结果与分析

4.4总结与讨论

第五章 MaACS2与4个AP2/ERF基因功能初探

5.1材料与方法

5.2实验方法

5.3结果与分析

5.4总结与讨论

第六章 综合与讨论

论文创新点

参考文献

附录

在读期间发表文章及参研课题

致谢