四氯苯醌诱导PC12细胞神经毒性的炎性有关信号通路分析

摘要

五氯酚(PCP)和六氯苯(HCB)是典型的持久性有机污染物，具有致畸、致癌、致突变性质，严重地威胁着人类身体健康。尽管二者在环境中化学性质很稳定，但仍然可以降解生成其他代谢产物。六氯苯可以通过细胞色素 P450途径代谢生成具有活性的四氯苯醌(TCBQ)和四氯氢醌(TCHQ)，五氯酚则可以通过鞘氨醇杆菌代谢为四氯苯醌，然后进一步还原成四氯氢醌。在这些代谢过程中会产生大量ROS，破坏生物体内的氧化还原平衡，导致毒性效应的发生，如遗传毒性、肝毒性、免疫毒性、神经毒性等。
　　随着人口老龄化现象地加重，许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森等疾病的患病率也逐渐增高。引起这些疾病的因素很多，包括环境、基因及老龄化等相关内源性因素，但基本可以概括为由于氧化应激的产生导致的神经炎症形成。近几年来，关于六氯苯和五氯酚的神经毒性研究已经很多，但是关于四氯苯醌的神经毒性，特别是炎症病理机制的研究资料却很少见。探讨四氯苯醌诱导PC12细胞炎症反应的机制，可以为有关神经系统疾病的预防和治疗提供新思路。因此，本文选用PC12细胞作为研究对象，设想它引起的炎症毒性与ROS的产生有关，做了以下两部分实验。
　　（一）四氯苯醌激活IKK/IκB/NF-κB信号通路的机制研究
　　本实验旨在比较六氯苯、五氯酚、四氯氢醌和四氯苯醌四种化合物对 PC12细胞的细胞毒性、ROS产量、促炎症因子表达的作用，然后进一步探讨四氯苯醌激活NF-κB信号通路的机制。首先利用CCK-8实验，比较了四种化合物在不同浓度、不同时间条件下的细胞毒性，结果发现四种化合物的细胞毒性呈现时间和浓度依赖性增加，并且与ROS的形成密切相关，其中TCBQ和TCHQ毒性强于PCP、HCB。从DCFH-DA探针检测ROS水平及免疫印迹检测促炎症因子表达的实验结果中发现TCBQ和TCHQ对ROS和促炎症因子的诱导作用强于HCB和PCP。接着用免疫印迹和 RT-qPCR实验手段从浓度梯度上考察了四氯苯醌诱导IKK/IκB/NF-κB信号通路相关炎症蛋白的表达情况及促炎症因子的mRNA水平，及采用NF-κB特异性抑制剂PDTC考察了TCBQ诱导NF-κB核转录活性。实验结果显示TCBQ可以诱导NF-κB信号通路中相关蛋白表达，还可以提高促炎症因子的mRNA水平，PDTC则明显抑制TCBQ诱导的NF-κB核转录及其与目的基因结合的活性。抗氧化剂NAC、维生素E和姜黄素可以清除TCBQ作用细胞产生的ROS，还可以部分抑制IKK/IκB/NF-κB信号通路中相关蛋白表达，这说明ROS在IKK/IκB/NF-κB信号通路的活化中扮演着重要角色。
　　（二）褪黑素拮抗四氯苯醌激活HMGB1/TLR4/MyD88信号通路的机制研究
　　四氯苯醌的促炎、促氧化作用在第一部分实验中已经得到证实；关于HMGB1/TLR4/MyD88在炎症研究中的重要性，很多文献都有介绍；褪黑素是松果体分泌的一种激素，为强大的内源性抗氧化剂，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用。基于以上三点，本实验把TCBQ、褪黑素、HMGB1/TLR4/MyD88三者联系起来，对它们的相互作用机制进行了探讨。
　　首先利用CCK-8实验筛选了褪黑素减缓 TCBQ细胞毒性的最适给药浓度，最终我们选用200μM褪黑素预处理细胞1h，再给予25μM TCBQ培养细胞6 h进行后面的实验研究。用免疫印迹实验、免疫共沉淀及RT-qPCR实验考察了TCBQ对TLR4、MD2、CD14、MyD88的影响，还考察了褪黑素在这个过程中的作用，结果发现 TCBQ可以诱导TLR4、MD2、CD14、MyD88的蛋白表达，TLR4和MyD88的mRNA水平上升，及促进TLR4与其适配器MD2、CD14、MyD88的结合，然而褪黑素抑制了TLR4和其适配器的表达，还抑制了它们的相互结合作用。接着也考察了褪黑素对TCBQ诱导的MAPKs活性的影响，及对下游炎症因子的表达情况，结果显示褪黑素可以逆转TCBQ对MAPKs活性的诱导作用。用TLR4 siRNA、MyD88 siRNA转染PC12细胞观察蛋白表达情况，用TLR4敲除的小鼠实验观察小鼠脑部切片的HE染色、免疫组化和免疫荧光图，发现TCBQ在TLR4和MyD88基因缺陷的情况下，炎症损伤明显降低，这强调了TLR4信号途径在TCBQ诱导的神经炎症中的重要作用。
　　接着我们探讨了TCBQ是如何激活TLR4信号通路的。通过免疫荧光、免疫印迹及免疫共沉淀实验，证明TCBQ可以使HMGB1在细胞核内发生乙酰化和磷酸化修饰，随后进入细胞质，释放到培养基里。用免疫印迹、免疫荧光、RT-qPCR和免疫共沉淀实验考察了TCBQ在HMGB1和其受体中的作用，结果发现TCBQ可以诱导HMGB1及其受体（TLR2、TLR4、TLR9、RAGE）的表达，及促进HMGB1与其受体的结合，在这些受体中，HMGB1与 TLR4的作用最强。接着通过蔗糖密度梯度分离实验，将裂解液分成12个片段，再利用免疫印迹实验证实TCBQ、HMGB1和LPS可以诱导TLR4/MD2向脂筏区域募集，褪黑素作为抗氧化剂跟NAC、脂筏抑制剂(β-环糊精和制霉菌素)显示相同的结果，这说明了ROS参与了TCBQ诱导TLR4向脂筏转运的过程。用HMGB1 siRNA转染PC12细胞，观察相关蛋白表达情况，发现褪黑素可以抑制HMGB1调控TCBQ诱导的TLR4信号途径。用TLR4基因敲除的小鼠，观察到TLR4基因缺陷可以保护TCBQ引起的小鼠脑损伤，同时还可以部分抑制HMGB1出核及释放。
　　综合以上两部分实验，可得知四氯苯醌诱导神经炎症反应，主要是通过活性氧激活IKK/IκB/NF-κB信号通路和促进细胞内HMGB1释放，随后招募TLR4向脂筏区域转录。

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第一章 绪论

1.1持久性有机污染物

1.2六氯苯

1.3五氯酚

1.4四氯苯醌

1.5褪黑素

1.6 NF-κB信号通路

1.7 HMGB1/TLR4/MyD88信号通路

1.8课题意义和依据

第二章 四氯苯醌激活IKK/IκB/NF-κB信号通路的机制研究

2.1引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5讨论

第三章 褪黑素拮抗TCBQ激活HMGB1/TLR4/MyD88信号通路的机制研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5讨论

全文总结

参考文献

致谢

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