莪术醇抗乳腺癌转移作用及潜在靶标的蛋白质组学分析

摘要

背景：乳腺癌是当今世界女性最多发的恶性肿瘤之一。2016年《Cancer Statistics》数据显示，2015年美国女性癌症发病率中乳腺癌以29％的比率独占鳌头，死亡率仅次于肺癌，居第二位。在中国，2009-2011年间女性癌症发病率显著增加。其中，乳腺癌位居第一位，且呈逐年增加态势。
　　中药莪术在传统上用于治疗宫颈癌、乳腺癌等妇科肿瘤，莪术油被认为是主要的活性物质基础，其中莪术醇是代表性化合物之一。目前，莪术醇抑制肿瘤转移的报道还很少，其潜在分子机制还需要深入研究。
　　本课题获得了中央高校基础研究重点项目基金(XDJK2014B044)的支持。目的：
　　进一步明确莪术醇在抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭与粘附方面的作用，深入地阐明其可能的新型分子机制和分析潜在的靶标蛋白。
　　方法：利用磺酰罗丹明B（SRB）法检测细胞存活率，平板克隆实验检测细胞生长状况。采用Ibidi划痕实验和Transwell迁移实验评价乳腺癌细胞体外的迁移能力。通过Transwell侵袭实验明确莪术醇对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。利用Matrigel粘附实验评价乳腺癌细胞粘附基底膜的能力。免疫印迹法（Western Blot）检测相关蛋白的表达，明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶的活性。采用双荧光素酶报告基因技术检测莪术醇对NF-κB转录活性的影响。
　　采用二维凝胶电泳技术分离莪术醇与溶剂对照处理后的MDA-MB-231细胞蛋白，分析差异表达蛋白，切取差异表达的蛋白点，并通过MALDI-TOF/TOF进行鉴定。利用Gene Ontology（GO）分析法明确差异蛋白的功能类别，利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析所涉及的相关通路，分析出可能与莪术醇抗乳腺癌转移作用相关的靶标，再利用Protein-Protein Interaction prediction（PPI）法找出与潜在靶标相互作用的蛋白质。最后，采用RT-PCR方确认在mRNA水平莪术醇对潜在蛋白靶标表达的影响。
　　结果：
　　1.莪术醇对乳腺癌细胞迁移、侵袭和粘附的影响
　　SRB法检测莪术醇细胞毒性显示，当莪术醇浓度小于40μg/ml作用24 h后对MDA-MB-231和4T1细胞无细胞毒性。连续处理14天后，40μg/ml莪术醇可显著抑制克隆的形成。为排除细胞毒性的影响，本研究选用10、20、40μg/ml浓度的莪术醇进一步明确其体外抗乳腺癌细胞迁移、侵袭和粘附能力。Transwell迁移实验和Ibdi划痕实验结果表明，莪术醇处理MDA-MB-231细胞8h后，其体外迁移能力显著降低。Transwell侵袭实验结果显示，莪术醇能够显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力。粘附实验结果表明，莪术醇能明显降低MDA-MB-231细胞粘附能力。
　　2.莪术醇抗乳腺癌细胞转移可能与JNK/Akt/NF-κB介导的MMP-9信号转导通路相关
　　明胶酶谱结果显示，莪术醇作用MDA-MB-231细胞24h后，MMP-9酶活性降低。Western Blot分析显示，莪术醇处理MDA-MB-231细胞后，MMP-9蛋白表达降低，JNK1/2、Akt磷酸化水平降低。同时，莪术醇亦抑制了NF-κB p65蛋白的核转移与转录活性。并且，JNK1/2抑制剂SP600125和PI3K-Akt抑制剂LY294002能够分别增强莪术醇对NF-κB p65蛋白核转移的抑制作用。同时，JNK1/2抑制剂SP600125、PI3K-Akt抑制剂LY294002和NF-κB抑制剂PDTC均能分别显著增强莪术醇对MDA-MB-231细胞MMP-9蛋白表达的抑制作用以及莪术醇对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和粘附的抑制作用。
　　3.蛋白质组学技术鉴定莪术醇抗乳腺癌转移作用的潜在靶标
　　采用二维凝胶电泳技术分离莪术醇与溶剂对照作用的MDA-MB-231细胞蛋白，共发现了19个差异蛋白，采用MALDI-TOF/TOF生物质谱成功鉴定了其中11个蛋白。GO分析显示，此11种蛋白分布在不同的细胞结构中，参与了多种重要的生物过程，表现出不同的分子功能。KEGG分析可知，鉴定的11种蛋白参与到76条信号通路中。特别地，结合GO分析结果，KEGG分析结果和查阅文献发现其中4个蛋白（EEF1A1、NRAS、SUB1、ACAT2）可能与莪术醇抑制MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和粘附有关。我们利用PPI分析得到与这4种蛋白相互作用的蛋白。最后，应用RT-PCR对这4个靶标在mRNA水平进行验证，证实了莪术醇能够在转录水平上剂量依赖性地调控这4个蛋白的mRNA水平，与基于二维凝胶技术的蛋白质组学结论相符合。
　　结论：莪术醇具有抑制乳腺癌细胞体外迁移、侵袭和粘附的作用，其调控机制一方面可能与JNK/Akt/NF-κB介导的MMP9信号转导通路有关。另一方面蛋白质组学分析发现EEF1A1、NRAS、SUB1、ACAT2可能是莪术醇抗乳腺癌细胞转移的潜在靶标。

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声明

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中文摘要

英文摘要

文献综述

莪术醇的主要来源

莪术醇的一般理化性质及增溶研究

莪术醇抗肿瘤机制研究进展

总结与讨论

第一章 选题依据

1.1．引言

1.2．肿瘤的转移与MMPs

1.3．莪术醇在乳腺癌治疗方面的研究进展与目前研究存在的问题

1.4．本课题的出发点及研究意义

1.5．课题研究的研究内容及预期结果

第二章 莪术醇对乳腺癌细胞迁移、侵袭和粘附的影响

2.1．仪器与材料

2.2．实验方法

2.3．结果

2.4．讨论

2.5．小结

第三章 莪术醇抑制乳腺癌细胞转移的基质金属蛋白酶机制研究

3.1．仪器与材料

3.2．实验方法

3.3．实验结果

3.4．讨论

3.5．小结

第四章 蛋白质组学技术分析莪术醇抗乳腺癌转移的潜在作用靶标

4.1．主要材料仪器

4.2．实验方法

4.3．实验结果

4.4．讨论

4.5．小结

全文总结

本课题的创新点

思考与展望

参考文献

中英文缩略名词对照表

致谢

硕士学位期间科研工作汇报