内皮细胞膜微粒对血管平滑肌细胞作用的研究

摘要

目的：将不同条件刺激人脑微血管内皮细胞(HBMEC)产生的内皮细胞膜微粒(EMPs)，作用于人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)，检测其对血管平滑肌细胞功能（细胞迁移、增殖和凋亡）的影响;并进一步检测其对血管平滑肌细胞迁移、增殖和凋亡功能影响的分子机制。 方法：体外培养人脑微血管内皮细胞，并分为SD和SD+TNF-α刺激两组，48小时后收集上清并离心提取膜微粒分别为sHB-EMPs和αHB-EMPs。通过流式细胞仪和透射电镜两种方法鉴定EMPs。sHB-EMPs和αHB-EMPs对人脑血管平滑肌细胞功能的影响:每个实验设置3个组，分别为加入sHB-EMPs的sHB-EMP组，加入αHB-EMPs的αHB-EMP组，及加入DMEM做为对照组的medium组。细胞划痕实验检测EMPs对HBVSMC迁移功能的影响;MTT法检测EMPs对HBVSMC增殖的影响;观察EMPs对HBVSMC凋亡的作用:先血清饥饿HBVSMC诱导其凋亡，再分别加入sHB-EMPs、αHB-EMPs和DMEM，24h后AnnexinⅤ/7-AAD凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测HBVSMC凋亡率;Westernblot检测平滑肌细胞增殖与迁移的相关蛋白ERK-1/2、p-ERK1/2、p38和p-p38的表达;凋亡蛋白caspase3的表达。 结果：⑴EMPs的鉴定:流式细胞仪检测到EMPs为PE-CD144阳性，大小为0.1-1μm微粒。透射电镜下可以看到膜微粒呈圆球状，大小约为0.1-1μm。⑵细胞划痕实验:sHB-EMP组和αHB-EMP组与medium组相比，人脑血管平滑肌细胞的迁移距离明显更小(P＜0.05);sHB-EMP组和αHB-EMP组相比较，αHB-EMP组迁移距离更小，有统计学差异(P＜0.05)。⑶MTT法检测细胞增殖:sHB-EMP组在细胞培养的4d、5d与medium组相比，OD值减低，有统计学差异(P＜0.05);αHB-EMP组在细胞培养的2d、3d、4d、5d分别与medium组和sHB-EMP组相比，OD值都减低，有统计学差异(P＜0.05)。⑷流式细胞仪检测细胞凋亡:在血清饥饿诱导HBVSMC凋亡的基础上，sHB-EMP组和αHB-EMP组可见PE-AnnexinⅤ+/7-AAD-所代表的细胞早期凋亡明显增多，与medium组相比有明显差异(P＜0.01);而sHB-EMP组和αHB-EMP组两组之间比较也有明显差异(P＜0.01)，αHB-EMP诱导HBVSMC凋亡更加明显。⑸Western blot检测:sHB-EMP组和medium组相比较:p-ERK1/2表达减少(P＜0.05)，p38表达也明显减少(P＜0.01)，caspase3表达明显增加(P＜0.01);αHB-EMP组和medium组相比较:p-ERK1/2表达明显减少(P＜0.01)，p38表达也明显减少(P＜0.01)，caspase3表达明显增加(P＜0.01); sHB-EMP组和αHB-EMP组相比:αHB-EMP组p-ERK1/2和p38的表达更少，两组有统计学差异（P＜0.05），αHB-EMP组caspase3表达增加更显著，两组有统计学差异(P＜0.01)。但ERK1/2和p-p38的表达三组间两两相比无明显差异（P＞0.05）。 结论：①sHB-EMPs和αHB-EMPs都可以抑制人脑血管平滑肌细胞的迁移和增殖，促进其凋亡;且αHB-EMPs对人脑血管平滑肌细胞这些功能的影响更显著。②sHB-EMPs和αHB-EMPs可以通过调节p-ERK1/2和p38的表达抑制人脑血管平滑肌细胞迁移和增殖，调节caspase3的表达促进其凋亡。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 内皮细胞微粒对动脉粥样硬化发生发展的作用

致谢

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况