黄连生物碱对HepG2细胞和金黄地鼠的协同降胆固醇活性及机制研究

摘要

心血管疾病是世界上的主要致死病因。众所周知，血脂异常是引发心血管疾病如冠心病，外周动脉疾病的主要危险因素之一，血脂异常指的是体内血清总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），低密度脂蛋白水平（LDL-c）和高密度脂蛋白（HDL-c）水平的一种或者几种发生异常。因此，改善血清脂质水平可以有效的干扰心血管疾病的进程。黄连具有抗菌、抗病毒、抗炎症、降血糖、降血脂等功效，小檗碱（BBR）、黄连碱（COP）、巴马汀（PAL）、表小檗碱（EPI）和药根碱（JAT）是黄连中主要的活性物质，它们具有相似的异喹啉结构，并且安全性相对较高。前期的研究表明这五种生物碱通过不同的分子机制展现出不同的降胆固醇活性。现在，针对治疗高血脂症的联合疗法被认为是一种新的治疗方案，它具有降脂作用活性高，用量少，副作用低等优势。因此，本实验研究，探索五种黄连生物碱（BBR，COP，PAL，JAT，EPI）对HepG2细胞和金黄地鼠的协同降胆固醇活性和机制的研究。
　　本实验研究的主要内容和结果：
　　（1）在对数期HepG2细胞生长状态良好的情况下，采用MTT实验检测不同浓度的黄连生物碱单体和复合物（COM）对细胞成活率的影响。结果表明，当BBR。COP。PAL。JAT。EPI和 COM的浓度小于等于5μg/ml时，药物对HepG2细胞成活率的影响很小，细胞成活率大于80％，没有明显毒性，所以，在当前实验条件下，BBR。COP。PAL。JAT。EPI和 COM浓度均选择5μg/ml作为后续细胞实验的适宜浓度。
　　（2）采用油红O染色法和HPLC分析法，探索比较黄连生物碱单体和复合物对高胆固醇诱导的Hep G2细胞的脂质积累和细胞内胆固醇水平的影响，结果表明，与生物碱单体组相比，COM能更有效的降低细胞内脂滴的积累和胆固醇水平。
　　（3）初步探究黄连生物碱单体和复合物对高胆固醇诱导的Hep G2细胞中胆固醇代谢关键靶点的影响。利用qRT-PCR，western blot和免疫荧光的方法，检测HepG2细胞中参与胆固醇代谢的关键基因LDL recptor，HMGCR和CYP7A1的表达。结果表明，与高胆固醇诱导组（HC）相比，五种生物碱单体和 COM组能不同程度的增加 LDL receptor和CYP7A1的表达，以及降低HMGCR的表达，尤其是COM组，与单体生物碱组相比，在调节胆固醇关键基因方面具有更明显的优势。
　　（4）进一步探究比较黄连生物碱单体和复合物对金黄地鼠脂质水平的影响。检测金黄地鼠的血清指标（TC，TG。LDL-c，HDL-c）以及粪便中的TC和总胆汁酸（TBA）水平，结果表明，高脂高胆固醇诱导的金黄地鼠（HFHC）血清中 TC，TG和 LDL-c水平增加，HDL-c水平降低。给药处理后，与HFHC组相比，TC，TG和 LDL-c水平得到显著的改善，相同剂量下，COM能分别显著降低 TC28.4%，TG34.7%，LDL-c22.3%，相反，HDL-c水平显著增加。与单体组相比，COM能更有效的改善血清中的脂质水平。此外，与生物碱单体组相比，COM有效增加粪便中TC和TBA的排出。因此，可以得出，当五种主要生物碱以一定比例复配到一起时，其降胆固醇的活性显著提升。
　　（5）为了进一步探究五种生物碱降胆固醇的协同效应，我们比较了BBR。COP。PAL。JAT，EPI和COM对金黄地鼠的血清和粪便中脂质指标的贡献率（CR）,结果表明，在改善脂质水平方面，黄连生物碱复合物的贡献率大于生物碱单独使用的贡献率总和，说明黄连生物碱五种主要单体联合使用具有协同效应，能增强降胆固醇的活性。
　　总的来说，黄连生物碱复合物在降低胆固醇方面具有协同效应，与黄连生物碱单体相比，具有更强的降胆固醇活性，其作用机制是上调LDL recptor和CYP7A1的表达，同时抑制HMGC R的表达。黄连生物碱联合疗法是一种治疗高胆固醇血症的潜在疗法。

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第1章 文献综述

1.1 高脂血症概述

1.2 高脂血症的引发因素

1.3 高脂血症的分类

1.4 高脂血症与代谢性疾疾病

1.5 胆固醇的代谢

1.6 高胆固醇血症的控制与治疗

1.7 黄连在治疗高脂血症方面的研究

1.8 本课题的可行性论证

第2章 引言

2.1 研究目的和意义

2.2 研究内容

第3章 黄连生物碱与复合物对HepG2细胞的降胆固醇作用

3.1 实验材料和仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 小结与讨论

第4章 黄连生物碱与复合物对金黄地鼠的降胆固醇作用

4.1 实验材料和仪器

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 小结与讨论

第5章 黄连生物碱复合物降胆固醇活性的协同效应

5.1实验材料与仪器

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 小结与讨论

第6章 总结与展望

参考文献

缩略语表

致谢

硕士期间参与发表的论文