细胞凋亡在斑马鱼泄殖腔发育中的功能研究

摘要

ARMs(肛门直肠畸形，Anorectal malformation)是一类先天性疾病的统称，它涉及肛门和直肠以及泌尿生殖道发育畸形，在新生儿中发生的概率约为1:5000。ARM的发生是胚胎发育障碍的结果，目前引起ARM的病因尚不清楚，遗传因素被认为是重要的ARM发病原因。泄殖腔发育缺陷会造成肛门直肠和泌尿生殖器畸形，在ARM发生中占有较高比例。
　　目前在人和小鼠中，有关泄殖腔是如何从一个空腔结构分离的说法不一，泄殖腔发育过程中细胞行为的研究也相对较少，而细胞行为与ARM疾病发生之间的关系尚不清楚。脊椎动物的胚胎发育具有保守的分子机制，斑马鱼作为模式动物，相较于小鼠具有较多优势，如体外受精、体外发育、胚体透明等，便于直接观察。斑马鱼泄殖腔的发育过程与人和小鼠的泄殖腔发育过程类似，都需要泄殖腔细胞团结构重塑，最终肾管和肠管分别以泄殖窦（或尿生殖窦）和肛门开口于外界，因此，斑马鱼适合用于研究泄殖腔的早期发育。
　　我们的研究表明斑马鱼泄殖腔是由腹侧原肛细胞团发育而来，胚胎受精后24小时（24hpf），泄殖腔的基本形态已经形成，可分为泄殖腔左壁、泄殖腔右壁及极腹侧泄殖腔膜，中间已有腔道形成。泄殖腔结构重塑的过程包括泄殖腔左壁与泄殖腔右壁的分离，中间腔室的形成、腹侧泄殖腔膜的消失及泄殖窦、肛管肛门的形成。在36hpf，可清晰地观察到泄殖腔壁变薄，肾管管壁与泄殖腔壁呈对接状。在48hpf肠道沿着前后轴发育到达泄殖腔左壁，泄殖腔腔室也随着左右壁的分开逐渐变大。在60hpf泄殖腔左右壁通过极腹侧泄殖腔膜相连，中间腔状结构十分明显。从60hpf到72hpf，泄殖腔的形态发生较大变化，连接泄殖腔左右壁的泄殖腔膜消失，杆状的泄殖腔壁也发生了形态的改变。随着左右壁的分开及泄殖腔膜的消失，肾管末端约在72hpf开口于外界。在84hpf，肠道末端与泄殖腔左壁细胞团融合，肠管末端及肾管末端形成倒U型结构。从96hpf到120hpf，与肠道末端连接的泄殖腔细胞团逐渐加厚，形成肛管肛门，肠管也逐渐开口通入肛管，经过肛管肛门与外界相通。在此过程中，我们观察到部分泄殖腔细胞与肠管末端对接融合的现象，因此我们支持泄殖腔从一个空腔结构分离的假说，空腔结构分离的原因是泄殖腔细胞的自主行为或响应周围信号所做出的反应，而不是尿直肠隔发育造成的泄殖腔壁被动分离。
　　我们用TUNEL、Caspase3抗体染色检测了斑马鱼胚胎发育过程中泄殖腔的细胞凋亡情况，发现1.5dpf和4.5dpf是泄殖腔细胞凋亡的高峰期，1.5dpf的凋亡信号集中在腹侧泄殖腔膜而4.5dpf的凋亡信号位于肛管肛门形成的部位。1.5dpf的凋亡高峰可能是泄殖腔腔腔室形成所需要的，而4.5dpf凋亡高峰是肛管肛门形成并与外界相通所需要的。为了研究细胞凋亡与泄殖腔发育之间的关系，我们过表达bcl2l，成功地抑制了早期泄殖腔的细胞凋亡，造成了泄殖腔膜的赘留，形成类似于人类中的泄殖腔畸形。而敲降baxa基因表达也能抑制早期泄殖腔细胞凋亡，造成泄殖腔畸形。泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理斑马鱼胚胎后，泄殖腔膜凋亡受阻，泄殖腔细胞团呈聚拢状，末端不能形成倒 U型结构，造成肠道、肾管的功能性障碍。我们的结果表明细胞凋亡对于泄殖腔的正常发育有非常重要的作用。

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第一部分文献综述

1.1 泄殖腔的概念

1.2 人和小鼠中泄殖腔的发育过程

1.3 人类泄殖腔发育异常相关的疾病

1.4 ARMs的病因学

1.5胚胎发育过程中后肠发育相关的特定基因或蛋白的分子功能

1.6 斑马鱼泄殖腔发育的研究现状

1.7 利用斑马鱼研究泄殖腔发育的优势

1.8 程序性细胞凋亡

1.9 本项目的立项依据、目的和意义

第二部分 材料和方法

2.1 实验动物

2.2 仪器、试剂和耗材

2.3 试剂配方

2.4 斑马鱼Total RNA的提取和cDNA的合成

2.5 反义RNA探针的制备

2.6 RNA的制备

2.7 全胚RNA 原位杂交

2.8 E.coli（大肠杆菌）感受态细胞的制备

2.9 Taq DNA polymerase的制备与提纯

2.10 基因组DNA的提取

2.11 目的基因的扩增、重组与转化

2.12 重组质粒的筛选、纯化和鉴定

2.13 细胞凋亡检测

2.14 显微注射

第三部分实验结果与讨论

3.1 斑马鱼泄殖腔的发育过程

3.2 转基因背景下泄殖腔的形态变化及与肾管肠管末端的互作行为

3.3 分子标记下泄殖腔的形态发生

3.4 泄殖腔形态发生过程中的细胞凋亡

3.5 泄殖腔细胞凋亡的抑制及其表型

3.6 实验结果总结

3.7 讨论与分析

参考文献

致谢