P38 MAPK和GCR在糖皮质激素调节星形胶质细胞GnRH表达中的作用

摘要

糖皮质激素（Glucocorticoid,GC）是一种类固醇激素，其浓度受到下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic-pituitary-adrenocoyical axis,HPA）轴的调控，在维持机体的稳态，调节生殖及免疫等功能中发挥了重要作用。促性腺激素释放激素（Gonadotropin-relesaing horme,GnRH）是一种10肽激素，是繁殖活动最重要的调节激素，主要通过下丘脑-垂体-性腺（Hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG）轴来对生殖活动进行调控。在应激情况下，HPA轴主要通过分泌GC影响HPG轴，从而影响生殖，母畜的生殖能力会通过此种方式而下降。星形胶质细胞在整个中枢神经系统中占据重要地位，尤其在生殖、免疫、应激等方面。根据本实验室已完成的工作中，已经在体外证明了星形胶质细胞能够分泌GnRH，然而其受到哪种信号通路的调节仍然未知。GC-GCR是糖皮质激素发挥经典基因组效应的系统，P38 MAPK是与免疫相关的最重要信号通路。但其两者在星形胶质细胞分泌GnRH中发挥怎样的作用，未有相关资料报道。因此，在应激情况下星形胶质细胞分泌GnRH会发生怎样的变化，星形胶质细胞分泌GnRH会受到怎样的调节成为了本实验的研究重点。
　　本实验利用体外培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞，探究P38 MAPK和GCR在糖皮质激素调节星形胶质细胞的GnRH表达中的作用，其中主要研究内容如下：
　　（1）不同浓度GC对星形胶质细胞分泌GnRH的影响；
　　（2）GCR在GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH中的作用；
　　（3）P38 MAPK信号通路对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响；
　　（4）P38 MAPK下游核转录因子NF-κB对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响。
　　（1）为了有效的探究P38 MAPK和GCR在糖皮质激素调节星形胶质细胞的GnRH表达中的作用，本实验采用1～3日龄的雌性SD新生大鼠，培养原代星形胶质细胞，经过原代培养、纯化和传代培养，获得所需细胞，经星形胶质细胞特异性标记蛋白-胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光染色检验细胞，所得细胞的纯化率达99％以上，可进行后续实验。
　　（2）为了研究不同浓度GC对星形胶质细胞分泌GnRH的影响，以糖皮质激素类似物地塞米松（DEX）刺激星形胶质细胞，用10-4 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L的DEX分别处理1 h、12 h、24 h、48 h后，利用ELISA检测不同浓度GC对星形胶质细胞GnRH的分泌情况、利用实时荧光定量PCR检测GnRH的mRNA转录水平，并利用Western Blot检测在各浓度GC处理下GCR的变化情况，结果显示，1 h、12 h、24 h、48 h时10-4 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L GC处理组的蛋白及mRNA转录水平均在不同阶段显著高于对照组（P<0.05），GCR在各时间段中对10-8 mol/L浓度的GC最为敏感，综合分析确定10-8 mol/L的GC为最佳的实验处理浓度。
　　（3）为了研究GCR在GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH中的作用，通过使用10-8 mol/L DEX-BSA与DEX分别刺激星形胶质细胞，分别设置GC-BSA组、GC组和对照组，用免疫荧光方法检测GCR的激活情况，并利用ELISA和实时荧光定量PCR方法对各组GnRH分泌量和mRNA转录水平的变化进行检测，结果显示，GC组在1 h、24 h转录水平显著高于对照组（P<0.05），12 h、24 h的蛋白水平显著高于对照组证明（P<0.05），而GC-BSA组在各时间段与对照组相比无显著性差异，证明当GCR激活后能够促进糖皮质激素刺激星形胶质细胞GnRH的分泌。
　　（4）为了研究P38 MAPK信号通路是否对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有调节作用，通过使用10μmol/L的P38阻断剂SB203580及10-8 mol/L DEX处理，分别设置P38阻断剂组、P38阻断剂+GC组、GC组与对照组，分别处理1 h、12 h、24 h、48 h后，检测各组GnRH分泌量、mRNA水平的变化及GCR激活情况，结果显示在12 h、24 h时P38阻断剂+GC组与GC组的蛋白及转录水平均显著高于对照组（P<0.05），且P38阻断剂+GC组在mRNA转录水平显著高于GC组（P<0.05），而在48 h时P38阻断剂+ GC组仍保持较高的分泌水平显著高于对照组（P<0.05），而P38阻断剂组的蛋白与转录水平在各时间段与对照组无显著性差异，综上所述表明，在GCR激活后，阻断P38 MAPK信号通路对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有上调作用。
　　（5）为了研究P38 MAPK对激活下游核转录因子NF-κB的影响，通过使用10μmol/L的P38阻断剂SB203580及10-8 mol/L DEX处理，分别设置P38阻断剂组、P38阻断剂+GC组、GC组与对照组，分别处理1 h、12 h、24 h、48 h后，并通过 WesternBlot检测不同时间NF-κB（P65）磷酸化情况。结果显示1 h、12 h时GC处理组的磷酸化P65表达量极显著高于对照组（P<0.01），24 h时显著高于对照组（P<0.05）；1 h、12 h时P38阻断剂组、P38阻断剂+GC组的磷酸化P65表达量极显著低于对照组（P<0.01），24 h时、P38阻断剂+GC组显著低于对照组（P<0.05）；1 h、12 h时P38阻断剂组与P38阻断剂+GC组的磷酸化P65表达量无显著差异（P>0.05）。证明经GC处理后的星形胶质细胞的磷酸化P65表达量会增加，在加入P38阻断剂后的星形胶质细胞磷酸化P65表达量会降低，并且该过程不会受到GC的刺激而增加。综上可知，P38 MAPK是引起核转录因子NF-κB磷酸化的关键激酶。
　　（6）为了研究P38 MAPK信号通路下游的NF-κB核转录因子是否对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有调节作用，通过使用10μmol/L NF-κB阻断剂BAY11-7082及10-8 mol/L DEX处理，分别设置NF-κB阻断剂组、NF-κB阻断剂+GC组、GC组与对照组，分别处理1 h、12 h、24 h、48 h后，检测各组GnRH分泌量、mRNA水平的变化及GCR信号通路激活情况，结果显示在12 h、24 h时NF-κB阻断剂+GC组、GC组的蛋白水平显著高于对照组（P<0.05），而NF-κB阻断剂+GC组在1 h、12 h、24 h、48 h极显著高于对照组与GC组（P<0.01）结果证明，在GCR激活后阻断P38 MAPK信号通路下游的核转录因子NF-κB对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有上调作用。
　　综上所述，该试验可以得到以下结果：
　　1、糖皮质激素在10-8 mol/L至10-4 mol/L浓度范围内，均能促进星形胶质细胞中分泌GnRH，且糖皮质激素浓度越高这种促进分泌作用时间越长。
　　2、糖皮质激素能够通过激活GCR促进星形胶质细胞分泌GnRH。
　　3、当GCR激活后，阻断P38 MAPK-NF-κB信号通路及对糖皮质激素刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有上调作用，即P38 MAPK-NF-κB信号通路对GCR在星形胶质细胞分泌GnRH的过程中具有抑制作用。
　　4、GCR在糖皮质激素促进星形胶质细胞分泌GnRH中起到主导作用。

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第一章 文献综述

1.1 糖皮质激素的作用机制研究进展

1.2 星形胶质细胞的重要生理功能研究进展

1.3 促性腺激素释放激素及其受体研究进展

1.4 P38 MAPK信号通路与糖皮质激素受体（GCR）的关系

第二章 引言

第三章 实验材料及方法

3.1 试验材料

3.2实验方法

第四章 结果与分析

4.1 星形胶质细胞的培养

4.2星形胶质细胞的纯度鉴定

4.3不同浓度GC对星形胶质细胞分泌GnRH的影响

4.4 GCR在GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH中的作用

4.5 P38 MAPK信号通路对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响

4.6 P38下游NF-κB对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响

第五章 分析与讨论

5.1关于GC最佳浓度的探讨

5.2关于GCR向细胞核汇聚现象的探讨

5.3 P38 MAPK 信号通路与GC对星形胶质细胞的作用的关系

5.4 NF-κB核转录因子与GC对星形胶质细胞的作用的关系

5.5 选题对生产实践的作用

第六章 结论

参考文献

致谢

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