犬弓首蛔虫卵黄原蛋白基因的克隆、表达及组织分布研究

摘要

弓首蛔虫病（Toxocariasis）主要是由犬弓首蛔虫（Toxocara canis, T. canis）寄生于宿主小肠而引起的一类寄生虫病。该病具有世界性分布的特点，有数据显示，世界各地T. canis的感染率为0.9％~64.7%。其感染性虫卵不仅可以感染犬，还可以感染多种动物及人类，能引起眼睛幼虫移行症（Ocular larva migrans, OLM）、神经幼虫移行症（Nerve larvae migration, NLM）、隐秘幼虫移行症（Cryptic larval migration, CLM）和内脏幼虫移行症（Visceral larva migrans, VLM），导致严重的病理综合征。因此，该病在兽医公共卫生学上具有十分重要的意义。
　　卵黄原蛋白（Vitellogenin, Vg）是脂质转运蛋白家族成员之一，通常是在卵生非哺乳动物的卵巢外组织中合成，经卵黄原蛋白受体（Vitellogenin receptor, VgR）介导的胞吞作用进入卵巢，分解为卵黄蛋白（Yolk protein, YP）、卵黄脂磷蛋白（Lipovitellin, Lv）、卵黄高磷蛋白（Phosvitin, Pv）等功能性物质。研究发现，Vg不仅为胚胎发育提供营养元素，还具有促进动物卵母细胞的生长和分化、粒子载体、生物标志物、抗氧化活性、免疫防御等多种生理功能。随着秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）卵黄原蛋白基因的发现，陆续展开了对有齿食道口线虫（Oesophagostomum dentatum）、捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）、毛圆线虫（Trichostrongylus vitrinus）等寄生虫卵黄原蛋白的相关研究，而有关犬弓首蛔虫Vg的研究还未见报道。
　　本论文在实验室已有的T. canis转录组数据基础上，对犬弓首蛔虫卵黄原蛋白(T. canis-vg, Tc-vg)基因进行了克隆、原核表达和组织定位等相关研究。主要试验结果如下：
　　1. Tc-vg基因的生物信息学分析
　　运用分子生物学技术对Tc-vg基因进行了分析，结果显示该基因为一个完整的编码区序列（Coding sequence, CDS），大小为5082 bp，可编码1694个氨基酸；理论分子质量为198 kDa，等电点为6.19。信号肽在线预测显示其N端含有一个信号肽，裂解位点在18-19 aa处。由在线软件分析显示该蛋白在一级结构上以亲水性为主；含有三个功能结构域：Vitellogenin_N、DUF1943(domain of unknown function)以及vWD(von Willebrand factor type D domain)。二级结构中含有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。在线分析TcVg磷酸化位点显示该蛋白中存在三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化苏氨酸（pThr）、磷酸化酪氨酸（pTyr）和磷酸化丝氨酸（pSer）共44个，分别为7、19、18。亚细胞定位分析为分泌通路；功能预测显示参与脂质分子的转运过程。根据Blast比对发现Tc-vg与猪蛔虫（Ascaris suum）、美洲钩虫（Necator americanus）和小杆线虫（Caenorhabditis briggsae）的相似性高达100%；系统进化分析显示Tc-vg与A. suum(ERG83573)的亲缘关系最近；与N. americanus(XP_013298422)、线虫（ Pristionchus pacificus, KKA71696)、十二指肠钩虫（ Ancylostoma duodenale, KIH69020）、捻转血矛线虫（ Haemonchus contortus, CDJ93502）、胎生网尾线虫（Dictyocaulus viviparus, KJH46366）等的亲缘关系次之。
　　2. Tc-vwd与Tc-duf1943结构域的克隆
　　运用PCR技术，克隆获得了Tc-vg基因的两个功能结构域（ Tc-duf1943和Tc-vwd）。其中，Tc-vwd结构域长度为834 bp，ORF长度为816 bp，编码272 aa，预测蛋白分子量大小为31.15 kDa，等电点为5.12。犬弓首蛔虫vWD(T. canis-vWD, TcvWD)蛋白主要参与发病机理的生物学过程。Tc-duf1943结构域长度为882 bp， ORF大小为864 bp，编码288 aa，预测成熟蛋白分子量为33.25 kDa，等电点为9.57。犬弓首蛔虫DUF1943（T. canis-DUF1943, TcDUF1943）蛋白主要具有脂质定位和有机物质运输的生物学过程。
　　3. Tc-vwd/pET28a与Tc-duf1943/pET28a表达载体的构建及原核表达
　　按照 TaKaRa公司的质粒提取试剂盒的说明对 Tc-vwd/pMD19-T、Tc-duf1943/pMD19-T和pET28a等质粒进行提取，酶切之后目的基因与pET28a进行连接，转化E. coli DH5α细胞，平板培养过夜，挑取单个白色菌落培养，PCR、双酶切及测序鉴定，将测序正确的重组质粒Tc-vwd/pET28a与Tc-duf1943/pET28a转化E. coli BL21(DE3)表达菌，挑取单菌落培养，当OD600值达到0.6~1.0时，加入IPTG进行诱导表达，同时对菌液进行IPTG浓度梯度和时间梯度的优化，筛选最佳的诱导条件。结果显示重组蛋白TcvWD与TcDUF1943均以包涵体形式存在，其中TcvWD大小约为40 kDa，TcDUF1943大小约为35 kDa；TcvWD蛋白于37℃，0.4 mM的IPTG诱导6 h时表达量最高，TcDUF1943在37℃，0.4 mM的IPTG诱导4h时表达量最高。
　　4. TcvWD多克隆抗体的制备及Western blot检测
　　对Tc-vwd/pET28a/BL21进行大量表达，离心收集包涵体沉淀，8 M尿素溶解，纯化上清，将重组蛋白TcvWD免疫新西兰白兔，2-3周免疫一次，共免疫四次，当效价大于1:50000时进行最终采血制备抗血清，对所得抗体进行效价、浓度、纯度测定。结果显示TcvWD融合蛋白纯度较高，所得抗体效价为1:512000，浓度为0.82 mg/ml，纯度合格。Western blot显示TcvWD能够与免疫抗血清反应，而不与免疫前血清反应，即TcvWD具有良好的特异性，可用于免疫组化试验。
　　5. Tc-vg特异性表达和TcVg免疫组织化学分析
　　运用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）方法检测Tc-vg基因的组织差异表达情况。结果显示Tc-vg基因在犬弓首蛔虫雌、雄虫肠道、生殖道和体壁均有表达，其中肠道表达量最高，体壁、生殖道次之。利用免疫组织化学技术对TcVg的组织分布情况进行了检测，结果显示TcVg在雌虫、雄虫各组织中均有表达，其中在肠道中高量表达，在生殖道和体壁如肌肉细胞、子宫和输精管内有较弱表达。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 寄生虫与宿主的相互作用

1.2 卵黄原蛋白概述

1.3 线虫卵黄原蛋白研究进展

1.4 结语

第二章 引言

2.1 研究背景及意义

2.2 主要研究内容

2.3 试验技术路线

第三章 犬弓首蛔虫卵黄原蛋白基因的生物信息学分析

3.1 试验方法

3.2 结果

3.3 分析与讨论

第四章 Tc-vwd、Tc-duf1943结构域的克隆及功能分析

4.1 材料与方法

4.2 试验结果

4.3 分析与讨论

第五章 Tc-vwd、Tc-duf1943表达载体的构建及原核表达

5.1 材料与方法

5.2 试验结果

5.3 分析与讨论

第六章 TcvWD多克隆抗体的制备及Western blot检测

6.1 材料与方法

6.2 试验结果

6.3 分析和讨论

第七章 犬弓首蛔虫卵黄原蛋白的组织分布研究

7.1 材料与方法

7.2 试验结果

7.3 分析与讨论

第八章 全文总结

参考文献

附录

在学期间发表论文

致谢