水稻类病斑早衰突变体lmps1的表型鉴定与基因定位

摘要

类病斑突变体常表现出对一种或多种病原菌的抗性，对于植物抗性育种和抗病机制研究具有重要意义。叶片衰老是叶发育的最后阶段，有研究表明，水稻籽粒灌浆所需营养物质主要来自于叶片光合作用，高达60％~80%，延缓叶片衰老有助于水稻增产。
　　经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变优良籼型水稻恢复系缙恢10号，获得一个稳定遗传的类病斑早衰突变体lmps1(lesion mimic and premature senescence1)。本研究以缙恢10号为野生型（WT）对照，对lmps1突变体进行表型鉴定、光合色素与光合参数分析、细胞超微结构分析、组织化学分析、抗氧化酶活性和 H2O2含量测定、防卫反应相关基因表达分析等一系列研究，并利用分子标记对控制该突变体性状的基因进行定位。主要结果如下：
　　1. lmps1突变体表型特征
　　lmps1突变体在苗期表现正常，到分蘖早期叶片开始出现褐色小斑点，斑点数目随着植株生长持续增加；进入孕穗期后，倒4叶尖开始萎黄，出现早衰表型；成熟期，斑点几乎布满所有叶片，衰老加速，整个植株呈黄褐色直至死亡。与WT相比，lmps1突变体的穗粒数显著降低，株高、穗长、有效穗数、结实率以及千粒重均极显著下降。
　　2. lmps1突变体的光响应
　　分蘖期对lmps1突变体尚未出现类病斑的叶片进行遮光处理，未遮光部位产生大量的斑点，而用锡箔纸遮光部位没有斑点或仅产生少量斑点；恢复光照后，遮光部位逐渐出现类病斑。表明lmps1类病斑突变表型的产生受光信号诱导。
　　3.光合色素含量测定
　　光合色素含量降低是植物叶片衰老的一个重要生理特征。孕穗期的光合色素含量测定结果显示，lmps1突变体的叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）、总叶绿素（Total Chl）及类胡萝卜素（Car）含量均极显著低于WT。其各功能叶之间的光合色素含量较WT也存在差异，其中倒3、倒4叶的Chla、Chlb、Total Chl及Car含量均极显著低于倒1叶和倒2叶；且除叶绿素b外，倒3叶Chla、Chlb、Car含量均显著高于倒4叶，而WT则是相反，倒3、倒4叶更高。叶绿素含量的变化表明lmps1叶片已经在生理水平上进入衰老阶段，且衰老是从倒4叶向倒1叶发展。
　　4.光合参数分析
　　光合色素含量降低必将影响光合效率。与WT相比，lmps1的净光合速率（Pn,μmol m-2 s-1）、气孔导度（Gs, mmol m-2 s-1）、胞间CO2浓度（Ci,μmol mol-1）与蒸腾速率（Tr, mmol m-2 s-1）均差异极显著。从各功能叶之间的光合参数来看， WT的Pn、Gs、Ci、Tr在倒1、倒2、倒3叶中依次显著降低。lmps1的Pn呈下降趋势，倒2、倒3叶之间无明显差异； Gs、Ci、Tr在倒3叶最高，倒1、倒2叶之间无明显差异。表明lmps1光合效率降低。
　　5.细胞超微结构比较
　　透射电镜观察结果显示lmps1的叶绿体数目减少，部分叶绿体类囊体片层结构严重损伤降解，且叶尖处降解程度比叶片中部严重。但lmps1叶肉细胞中也存在结构完好的叶绿体，表明受损叶绿体前期发育良好，在叶片早衰过程中逐渐降解消亡。lmps1叶绿体的降解模式，与其叶片的衰老表型基本一致，即叶尖开始，然后逐渐向突变体叶片中部与基部延伸。
　　6.组织化学分析
　　孕穗期对WT和lmps1突变体的叶片进行硝基蓝四氮唑（NBT）和台盼蓝染色。NBT染色结果显示，lmps1突变体的叶片斑点部位及其周围被染成深蓝色，而WT叶片仅有极少数深蓝色小斑点。经台盼蓝染色后，突变体lmps1的叶片斑点部位及其周围被染成深蓝色，WT叶片呈现出较为均匀的蓝色。表明 lmps1突变体的斑点部位伴随着活性氧（ROS）积累，并且该处有大量细胞死亡或细胞膜遭到破坏。
　　7.叶片H2O2含量检测及抗氧化酶活性变化
　　与WT相比：孕穗期的lmps1各叶片H2O2含量显著升高；倒2叶和倒3叶的POD活性降低， CAT活性在倒1叶、倒2叶、倒3叶中显著降低；SOD活性在倒1叶中与WT无明显差异，倒2和倒3叶中显著降低。WT和lmps1突变体各功能叶之间的SOD活性、CAT活性均随叶龄增长而降低，差异显著，而POD活性在各功能叶片中差异不显著。
　　抗氧化酶活性和过氧化氢含量变化表明在lmps1突变体植株体内，随着突变表型的出现，其叶片细胞遭受ROS胁迫，从而导致细胞死亡。
　　8. lmps1遗传模式分析
　　用籼稻西农1A与lmps1突变体构建的F1群体表型均与野生型一致，F2代发生性状分离。共收获正常单株1214株、类病斑早衰突变单株420株，正常单株与突变表型单株数目的比值为2.89:1。经卡平方测验，基本符合隐性基因3:1的分离比例（χ2=0.3949，P=0.5211），表明lmps1突变体的类病斑早衰性状受1对隐性核基因控制。
　　9. lmps1基因定位
　　用西农1A与lmps1构建的F2群体进行基因定位。结果显示InDel标记ZTQ66在正常池和突变池之间存在差异，初步确定该标记与LMPS1基因连锁。进一步在ZTQ66两侧设计新的InDel标记，根据交换单株在多态标记间的变化情况，最终LMPS1基因定位在第7染色体长臂上端粒附近的CY7-8和CY7-60之间，目标基因距这2个标记的遗传距离分别是0.83cM和0.71cM，两标记间物理距离约为167.3Kb。
　　10.防卫反应相关基因表达量分析
　　类病斑突变体中常伴随防卫反应相关基因表达的变化，可能是类病斑突变体对病原菌抗性增强原因之一。对野生型与lmps1防卫反应相关基因定量分析，结果显示，lmps1除POX22.3相对WT下调9倍外，其余POC1、PAL、PBZ1、PR1、NPR1、PR5表达量明显升高。防卫反应相关基因相对于WT的表达量的变化，表明lmps1的突变可能激活部分病程相关因子，引起水稻防卫反应。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1植物类病斑突变体

1.2水稻类病斑突变体的研究进展

1.3植物叶片的衰老

1.4水稻类病斑早衰突变体

第2章 引言

第3章 材料与方法

3.1实验材料

3.2实验方法

第4章 结果

4.1 lmps1突变体的形态鉴定

4.2 lmps1突变体对光的响应

4.3光合色素含量分析

4.4光合效率变化

4.5细胞超微结构分析

4.6组织化学分析

4.7抗氧化酶活性分析

4.8 H2O2含量分析

4.9遗传分析

4.10 lmps1突变体的基因定位

4.11定量分析

第5章 讨论与结论

5.1讨论

5.2主要结论

参考文献

致谢

发表的论文