紫花椰菜MYB-TT8-TTG1转录因子调控烟草花青素积累的研究

摘要

花青素是一类黄酮类化合物，对植物生长和动物健康都具有积极的意义。对于植物本身而言，花青素赋予植物营养器官、生殖器官等鲜艳的颜色，避免植物细胞受到病害、光照、氧化性的伤害，延长果品货架期及增加植物对逆境条件的适应能力等。花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用，在食品、化妆、医药方面有着巨大应用潜力。
　　近年来，调控植物花青素合成途径的分子机制越来越明晰。其中MYB、bHLH和WD40这三类转录因子所组成的MBW（MYB-bHLH-WD40）转录复合体被广泛证明卷入了花青素合成调控。鉴于来自不同物种的转录因子异源表达后常表现出与原植物中不同的花青素调控模式，且这三个转录因子如何在异源植物中协同调控花青素的合成机制仍不清楚。因此，本研究从紫色花椰菜中分离三个转录因子BoMYB2、BoTT8和BoTTG1在35S启动子的驱动下在烟草中单独或共表达，比较其形态学特征、花青素积累模式以及花青素合成结构基因的表达，揭示了三个基因在烟草花青素积累中的功能和作用。本研究中获得主要结果如下：
　　1.提取紫花菜品种Graffiti花球总RNA，逆转录获得cDNA，根据 Genbank公布的GU219986，GU219990以及GU21999序列信息，设计相应的特异引物。从cDNA中分别分离到744bp BoMYB2基因，1566bp BoTT8基因，1014bp BoTTG1基因。经核苷酸序列、氨基酸序列比较、进化树分析，显示获得的基因为调控花青素合成的三个重要转录因子。
　　2.构建了以 Bar基因为筛选标记的植物表达载体35Spro:MYB2、35Spro:TT8和35Spro:MYB2TT8以及Hpt基因为筛选标记的35Spro:TTG1的植物表达载体。通过农杆菌介导的单独叶盘转化或者共转化法将其导入普通烟草，分别获得35Spro:MYB2，35Spro:TT8和35Spro:TTG1三个单转录因子表达植株；35Spro:MYB2TT8，35Spro:MYB2TTG1和35Spro:TT8TTG1三个双转录因子共表达植株；一个35Spro:MYB2TT8TTG1三转录因子共表达植株。35Spro:TT8，35Spro:TTG1以及35Spro:TT8TTG1转基因在愈伤组织、根系及嫩叶中均未见花青素积累。而所有表达 BoMYB2转录因子的转基因烟草，其愈伤组织、根系及嫩叶中均可见花青素积累，其中35Spro:MYB2TT8和35Spro:MYB2TT8TTG1的愈伤组织、根、茎、叶均呈紫色，花青素积累量更高。针对花青素合成途径的结构基因的表达分析显示，所有基因型的转基因烟草叶片中的EBGs表达量与野生型间无较大的差异，而积累花青素的35Spro:MYB2、35Spro:MYB2TTG1、35Spro:MYB2TT8基因型的转基因烟草叶片的LBGs（NtF3Ha，NtDFR和NtANS）的表达量明显高于野生型、35Spro:TT8、35Spro:TTG1及35Spro:TT8TTG1植株。显示BoMYB2转录因子是调控花青素合成的关键因子。
　　3.凡表达BoMYB2基因的转基因植株的花器官中表现出强烈的色素积累。尽管35Spro:TT8和35Spro:TT8TTG1转基因烟草植株在营养器官无花青素积累，但在花器官中可见明显的花色素积累。针对花青素合成途径中的结构基因表达分析发现，所有基因型的转基因植株EBGs的表达没有差异，而LBGs（NtDFR和NtANS）的表达量得到上调。表明BoTT8转录因子能单独调控花器官中花青素的积累。
　　4.在种子发芽以及苗期阶段，转录因子BoTT8和BoTTG1不影响花青素的合成和积累。BoMYB2单独表达促进花青素在种子发芽后的子叶以及幼嫩的真叶中积累。但BoMYB2和BoTTG1共表达后抑制花青素在发芽的子叶中积累而促进其在幼嫩的真叶中积累。BoMYB2和BoTT8共表达，BoMYB2、BoTT8和BoTTG1共表达均导致花青素在萌发后的子叶、胚轴、根尖、幼苗真叶中大量积累。
　　5.比较转基因植株的T1种子萌发后的根系结果显示，BoTTG1基因型T1代植株的根系长于野生型，而BoTT8和BoTT8TTG1基因型T1代植株的根系短于BoTTG1基因型和野生型，BoMYB2、BoMYB2TTG1的T1代根系长度也明显短于野生型。而共表达BoMYB2和BoTT8以及共表达BoMYB2，BoTT8和BoTTG1转基因的T1代植株根系的长度最短。以上结果表明异源表达BoTTG1转录因子对根系的生长具有促进作用，而BoTT8和BoMYB2对根系的生长具有抑制作用。

目录

声明

第一章 绪论

1.1花青素生物功能及合成途径

1.2 转录因子与花青素积累

1.3 十字花科作物中转录因子的研究进展

第二章 引言

2.1 研究的目的及意义

2.2 研究思路与技术路线

第三章 材料与方法

3.1材料

3.2 主要溶液及培养基配方

3.3 主要仪器设备

3.4 实验引物

3.5 实验方法

第四章 结果与分析

4.1 BoMYB2，BoTT8，BoTTG1基因的获得

4.2 目标基因序列生物信息学分析

4.3载体构建

4.4 农杆菌介导转化法获得转基因烟草植株

4.5 转基因植株形态学及花青素积累比较

4.6 转基因植株幼苗根系发育特点

第五章 讨论

5.1 BoMYB2是调控花青素合成的关键因子

5.2 BoTT8调控花器官中花青素的积累

5.3 BoTTG1超表达不影响花青素积累但促进根的生长

5.4 BoMYB2-BoTT8-BoTTG1复合体调控花青素积累

第六章 结论

6.1 BoMYB2转录因子是调控花青素合成的关键因子

6.2 BoTT8转录因子特异性的调控花器官中花青素的积累

6.3烟草种子胚主要受BoMYB2、BoTT8基因共同表达调控

6.4 BoTTG1转录因子促进根系生长而BoTT8和BoMYB2抑制根系生长

参考文献

致谢

附录

附录1 培养瓶中生长的35SPro:MYB2TT8TTG1转基因植株

附录2 缩略词

附录3 35SPro:MYB2TT8和35SPro:MYB2TT8TTG1胚乳颜色标记验证