甘蓝型油菜BnWRKY41-1转录因子在拟南芥叶片花青素积累方面的功能分析

摘要

作为我国种植面积最大的油料作物和世界第三大消耗食用油的来源，油菜在保障粮食安全中占据着举足轻重的地位。花青素在改善菜籽油品质、提供油菜选育的性状标记、提高油菜抗逆性和培育多彩油菜品种等方面发挥着积极的作用。为了优化花青素对油菜的效用，需要不断完善油菜花青素合成路径相关的基因网络。 本研究发现BnWRKY41-1转录因子通过负调控五个花青素积累相关基因的表达，抑制了拟南芥叶片的花青素含量。为进一步揭示BnWRKY41在油菜中的功能奠定了基础。主要结果如下： 1.在甘蓝型油菜中，共存在两个WRKY41同源拷贝，分别为BnWRKY41-1（XP_013686534.1）和BnWRKY41-2（XP_013695247.1）。本研究从Westar油菜品种中克隆得到BnWRKY41-1。蛋白质序列比对和系统进化分析表明，BnWRKY41-1与拟南芥AtWRKY41的亲缘关系较近，两者功能域的相似度是92%，所以两者调控的下游基因和造成的表型变化很有可能是相似的。 2.将pGreen-35S:BnWRKY41-1-6HA转入拟南芥wrky41-2突变体（SALK_028449.34.95.x），用纯合的T3代转基因株系进行实验。在发芽后15、20和25天（DAG），wrky41-2的叶片花青素含量均显著高于Col-0，而BnWRKY4-1能够恢复wrky41-2的叶片花青素含量。所以AtWRKY41和BnWRKY41-1转录因子在花青素合成方面具有相似的生物学功能。 3.选择花青素含量差异增加最快的时期（20DAG）,取莲座叶进行以下实验。首先，利用RNA-seq和qRT-PCR，发现和Col-0野生型相比，五个花青素含量相关的差异基因（ACR-DEGs,anthocyanin content related differentially expressed genes）在wrky41-2突变体中被显著上调，分别是AtMYB75、AtMYB111、AtMYBD、GSTF12和AT1G68440。并且，通过在wrky41-2突变体中过量表达BnWRKY41-1，这些ACR-DEGs的表达量降低到了野生型的水平。最后，ChIP-qPCR的结果显示，AtWRKY41和BnWRKY41-1转录因子在部分ACR-DEGs的启动子区域具有结合位点，所以AtWRKY41和BnWRKY41-1间接或直接负调控以上五个ACR-DEGs的表达。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 植物类黄酮概述

1.2.1 花青素的结构

1.2.2 花青素的生物合成

1.2.3 花青素抗氧化的机理

1.2.4 花青素对作物的功能

1.3 WRKY转录因子

1.3.1 WRKY转录因子的结构与分类

1.3.2 WRKY转录因子与DNA的结合

1.3.3 WRKY转录因子在植物中的功能

1.4 问题的提出与研究意义

第二章 材料与方法

2.1 植物材料

2.2 实验方法

2.2.1蛋白质多序列比对

2.2.2 WRKY41蛋白质序列的系统进化分析

2.2.3 引物设计

2.2.4 基因克隆与载体构建

2.2.5 烟草叶片亚细胞定位

2.2.6 拟南芥的转化与转基因植株的筛选

2.2.7 基因型鉴定

2.2.8 基因表达分析

2.2.9 叶片花青素含量测定

2.2.10 转录组测序（RNA-seq）

2.2.11 染色质免疫沉淀（ChIP）

第三章 BnWRKY41-1调控叶片花青素积累的机理分析

3.1 前言与技术路线

3.2 结果与分析

3.2.1 BnWRKY41-1蛋白质的序列分析

3.2.2 BnWRKY41-1的亚细胞定位

3.2.3 植物材料的鉴定

3.2.4 叶片花青素含量的动态分析

3.2.5 Col-0和wrky41-2间ACR-DEGs（花青素相关差异基因）的挖掘

3.2.6 ACR-DEGs的验证

3.2.7 AtWRKY41和BnWRKY41-1与ACR-DEGs结合位点的分析

3.3 讨论

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

致谢

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