人鞭虫乳清酸蛋白3的原核表达、纯化及其生物活性研究

摘要

【目的】 1.对预测的TtWAP-3进行生物信息学分析 2.构建重组质粒pET-32a-sumo/TtWAP-3，并转入E.coli BL21(DE3)中 3.诱导表达、并分离纯化获得rTtWAP-3 4.检测rTtWAP-3对蛋白酶的抑制作用 【方法】 1. TtWAP-3的生物信息学分析 根据课题组前期对人鞭虫（Trichuris trichiura）成虫的转录组测序结果，获得了预测的人鞭虫乳清酸蛋白TtWAP-3的完整编码序列；利用在线生物信息学程序检索该蛋白的相似性，并构建同源蛋白的系统进化树，预测其信号肽、理化性质、利用同源建模分析预测TtWAP-3与中性粒细胞弹性蛋白酶的作用位点。 2. TtWAP-3的原核表达系统的构建 以鞭虫成虫cDNA为模板，通过PCR扩增获得TtWAP-3成熟肽编码序列，经用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切后，将其连接到表达载体pET32a-sumo。构建的重组质粒转化至E.coli DH5α，经菌液PCR、双酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒命名为pET32a-sumo/TtWAP-3，并进一步将该重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，并鉴定。 3.重组TtWAP-3的诱导表达及纯化 挑取经鉴定正确含重组质粒的E.coli BL21(DE3)用LB培养基培养，IPTG诱导表达，离心得到菌体。菌体经超声破碎后，离心取上清，上清经Ni-NTA亲和纯化获取融合蛋白，融合蛋白经Sephadex G25去盐、SUMO蛋白酶柱上酶切，收集穿透液，获得rTtWAP-3备用。用15%SDS-PAGE分析蛋白表达及纯化情况。 4. rTtWAP-3对丝氨蛋白酶抑制活性的检测 运用发色底物法检测rTtWAP-3对猪胰蛋白酶、牛α-胰糜蛋白酶及人源性胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰糜蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、组织蛋白酶G、蛋白酶3（PR3）等的抑制活性，并分析IC50。 【结果】 1. TtWAP-3的息学分析TtWAP3全长cDNA序列编码172个氨基酸，含20个氨基酸残基组成的信号肽和152个氨基酸残基组成的成熟肽；预测成熟肽的分子量为16272.3Da，理论等电点位4.5；与 Genbank中预测的一段由159个氨基酸残基组成的人鞭虫蛋白（Genbank No.CDW60663）相似性最大，具有99%的一致性。TtWAP-3第25~68位氨基酸残基形成含6个半胱氨酸残基WAP结构域。同源建模后的二级结构含有有一个α螺旋、两个β折叠和无规则卷曲三种结构构成；TtWAP-3与中性粒细胞弹性蛋白酶的模拟对接显示它们之间有4氢键的相互作用。 2.原核表达系统的构建成功将TtWAP-3编码序列连接到pET32a-sumo，获得了重组质粒pET32a-sumo/ TtWAP-3，并转化到E.coliBL21(DE3)。 3. rTtWAP-3的诱导表达与纯化含重组质粒的E.coli BL21(DE3)经诱导表达、离心分离、Ni-NTA亲和层析纯化获得了重组融合蛋白，融合蛋白经SUMO酶酶切去除融合伴侣后得到纯化的目的蛋白rTtWAP-3。 4. rTtWAP-3对蛋白酶的抑制作用在终浓度1000nM下，rTtWAP-3对人NE及 PR3酶活性具有一定抑制作用，但对人中性粒细胞组织蛋白酶 G、牛α-胰糜蛋白酶、猪胰蛋白酶及人胰糜蛋白酶均无明显的抑制作用。其抑制 NE及PR3的IC50分别约为2.25μM、5.34μM。 【结论】 本文获得了TtWAP-3全长编码序列，其属于WAP蛋白家族新成员。成功构建了原核重组表达质粒 pET32a-sumo/TtWAP-3，并制备获得了 rTtWAP-3；rTtWAP-3对人NE和PR3具有一定抑制活性，提示其可能参与调控宿主免疫功能及炎症反应。本研究结果为进一步研究 TtWAP-3对炎症和宿主免疫的调节作用奠定了基础。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 TtWAP-3的生物信息学分析

2.1 分析的工具

2.2 分析的方法

2.3 分析结果

2.4 讨论

3 TtWAP-3原核表达及纯化

3.1 实验材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

4. rTtWAP-3对蛋白酶的抑制作用的检测

4.1 实验材料与仪器

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

5小结

参考文献

综述:分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（SLPI）在宿主防御作用研究的进展

致谢

附录一: 缩写词中英文对照

附录二 在读硕士研究生期间的科研情况