桑辛素通过下调c‐Myc的表达来抑制胃癌细胞的增殖和肿瘤生长

摘要

近年来尽管胃癌的发病率有所降低，但是其依旧是世界上患者最多的癌症之一。在发展中国家中，胃癌是致死率最高的三种癌症之一，每年约有十万胃癌新生病人。虽然我们在胃癌的放化疗方面取得了极大的进步，但是胃癌病人的预后情况依旧不理想，平均五年的生存率不到30%。因此，筛选有效的胃癌药物，对于提高胃癌病人的治疗效果及生存率拥有非凡的意义。黄酮类化合物包括黄酮、黄烷酮、异黄酮、二氢异黄酮、二氢查尔酮等几大类，据报道黄酮类化合物具有抗肿瘤活性。比如，黄芩素作为一种派生类黄酮，拥有多种不同的生物活性，其可以诱导膀胱癌的凋亡，同时还可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。另外黄酮前体查尔酮可以通过抑制NF-κB的活性从而抑制胃癌细胞的生长，同时可以上调DR4和DR5的表达，从而引起结肠癌和肝癌的凋亡。桑辛素作为一种桑白皮（桑树根部的皮）富含的黄酮类化合物，据报道其可以通过抑制NF-κB的活性来诱导宫颈癌和结肠癌的凋亡。同时能够通过调节EGFR及DR5的活性，来诱导胶质瘤细胞的凋亡。不仅如此，同时桑辛素能够抑制STAT3的活性，从而诱导前列腺癌细胞的死亡。
　　本研究主要内容包括：⑴使用不同浓度的桑辛素对两种胃癌细胞系（MKN45及SGC7901）进行处理后，细胞增殖率结果显示，桑辛素显著地抑制了胃癌细胞的增殖，同时MTT实验及BrdU实验也得到了同样的结果。为探索桑辛素抑制胃癌细胞增殖的机制，进行了细胞周期分析，结果显示桑辛素可以将胃癌细胞阻滞在 G1期。同时为了探索桑辛素阻滞细胞周期的分子机制，通过 western blot实验对细胞周期相关蛋白表达进行检测，发现桑辛素下调了CDK2，CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1的表达。以上实验结果表明，桑辛素可以下调细胞周期相关蛋白的表达，从而抑制胃癌细胞的细胞周期进程及细胞增殖。⑵为探索桑辛素对胃癌细胞体外成瘤的影响，我们进行了Soft Agar实验，结果显示相对于对照组而言，桑辛素处理组克隆数目较少且体积较小，桑辛素抑制了胃癌细胞体外成瘤。同时进行了小鼠移植瘤实验，对肿瘤生长情况进行统计分析发现，桑辛素显著抑制了肿瘤的生长。对各组肿瘤进行免疫组化分析，结果显示桑辛素处理组生长标志物Ki67阳性细胞率显著下降。对CDK2，CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1在肿瘤中的表达情况进行分析发现，四种周期蛋白表达均显著降低。以上实验结果表明，无论在体内还是体外，桑辛素均可通过阻滞细胞周期来抑制肿瘤的生长。⑶Western blot实验表明桑辛素可以下调c-Myc的表达，并且这种下调作用有时间和浓度的依耐性，免疫组化分析也表明桑辛素可以抑制c-Myc在肿瘤内的表达。为了研究c-Myc在桑辛素调节细胞增殖中的作用，我们构建了 c-Myc过表达的胃癌细胞系。对正常的胃癌细胞系和过表达c-Myc细胞系进行药物处理后，MTT实验结果表明，c-Myc可以减缓桑辛素对胃癌细胞增殖的抑制作用。在c-Myc过表达的细胞系中，四种细胞周期蛋白（CDK2，CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1）的表达均有不同程度的上调。由于c-Myc是通过识别“E-box”序列，从而结合到靶基因的启动子上来调控下游基因的表达，为研究c-Myc是否结合到CDK2，CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1的启动子上，我们进行了ChIP实验。ChIP实验结果表明c-Myc可以通过识别“E-box”序列，从而结合到CDK4，Cyclin D1以及Cyclin E1的启动子上。虽然CDK2启动上也存在“E-box”序列，但是我们的结果并没有发现c-Myc可以结合到CDK2的启动子。综上所述，桑辛素通过下调c-Myc的表达来抑制细胞周期相关蛋白的表达。⑷提出假设：桑辛素通过下调 c-Myc的表达来抑制细胞周期进程。为了验证我们的假设，在过表达 c-Myc和正常的胃癌细胞添加桑辛素处理后，进行细胞周期分析，结果显示过表达c-Myc可以显著降低处于G1期的细胞比例。western blot实验结果表明，在桑辛素处理后，过表达c-Myc细胞系相对于对照组而言，CDKs以Cyclins的表达量都相对较高，以上实验结果表明，过表达 c-Myc可以减缓桑辛素对胃癌细胞细胞周期的阻滞。我们发现桑辛素可以显著抑制c-Myc的表达，且原癌基因c-Myc在肿瘤发生和生长方面发挥着重要的作用，所以在对过表达c-Myc的细胞系和正常胃癌细胞系进行药物处理后，在体外我们检测了各组细胞的成瘤能力，结果表明过表达c-Myc的细胞系相对于对照组而言，成瘤数目有显著的提升。小鼠移植瘤实验也表明，过表达c-Myc可以减缓桑辛素对肿瘤生长的抑制作用。以上实验结果表明桑辛素通过下调c-Myc的表达来抑制细胞周期和肿瘤生长。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1桑辛素概述

1.2胃癌概述

1.3 c-Myc与细胞周期调控

第2章 引言

2.1研究目的及意义

2.2主要研究内容

第3章 桑辛素对胃癌细胞系增殖及周期的影响

3.1材料和试剂

3.2实验方法

3.3实验结果与分析

3.4讨论

第4章 桑辛素对肿瘤生长的影响

4.1材料和试剂

4.2实验方法

4.3实验结果与分析

4.4讨论

第5章 桑辛素对原癌基因c-Myc的影响

5.1材料和试剂

5.2实验方法

5.3实验结果与分析

5.4讨论

第6章 c-Myc对细胞周期蛋白的影响

6.1材料和试剂

6.2实验方法

6.3实验结果与分析

6.4讨论

第7章 过表达c-Myc对细胞耐药性的影响

7.1材料和试剂

7.2实验方法

7.3实验结果与分析

7.4讨论

第8章 全文总结

参考文献

在读期间发表论文及参研课题情况

发表论文目录

参研课题目录

致谢